熒光原位雜交 (簡稱 FISH)——一種重要的細胞遺傳學技術，該技術用于獲取空間基因組和轉錄組信息。FISH 廣泛應用于基因組學和細胞生物學研究，以及預防醫學、生殖醫學和腫瘤學等領域的診斷應用。

它是檢測染色體異常的金標準技術！

熒光原位雜交是一種用于檢測和定位染色體上特定 DNA 序列的實驗室技術。該技術將個體的全套染色體固定在載玻片上，然后用 "探針" (一小段標記有熒光染料的純化 DNA)進行染色。熒光標記的探針會找到并結合染色體上的對應序列。借助專用顯微鏡，可以觀察到熒光探針結合的染色體及其亞染色體區域。常用來確定結合了熒光探針的 DNA 區域、RNA 分子在染色體及其他細胞器中的定位 (圖 1)。

? 高靈敏度與特異性：可精準檢測并定位目標核酸序列，即便處于復雜細胞環境中，也能有效區分目標序列與非目標序列。

? 支持多色熒光標記：能夠同時檢測多個目標序列，顯著提升檢測效率與準確性。

? 直觀可視化效果：借助熒光顯微鏡，可直接觀察目標序列在細胞或組織內的分布及定位情況。

? 適用范圍廣泛：可應用于分裂與非分裂細胞，能夠檢測隱性基因缺失、基因易位及低水平基因嵌合體，且可在石蠟包埋組織 (PET) 切片上進行操作。

FISH 實驗的核心步驟為：樣品制備 →預處理 →雜交 →洗滌 →復染與封片 →熒光顯微鏡觀察與分析。

其中，樣品預處理的關鍵在于暴露細胞或組織內的核酸，以確保探針有效結合，這一過程通常涉及蛋白酶消化與梯度乙醇脫水操作。組織預處理步驟見圖 2。

組織預處理完成后，使用疏水屏障筆對載玻片上的組織進行包膜處理 (圈畫)，隨后置于蛋白酶溶液中室溫孵育。洗滌后，將組織轉移至臺式培養箱雜交 2 小時，再依次進行擴增步驟。完成 FISH 探針處理后，組織需先洗滌，再用正常馬血清封閉。一抗孵育在 4°C 條件下過夜進行，以確保抗體與抗原的充分結合；二抗孵育則在室溫下持續 2 小時 (圖 3)。

相信涉及該實驗的小伙伴大部分都會師承同門，先從“打下手" 的小跟班做起，再對著師兄師姐的實驗記錄本 “咔嚓" ，出師，迫不及待親自嘗試一番！

我知道你急，但咱先別急。上述只介紹了組織的處理步驟，如果你的樣本是細胞，還是要乖乖做細胞爬片喔~

mRNA FISH 和 IHC 成像結合可用于表征 AD 模型中補體靶向療法的療效，或結合其他與阿爾茨海默病病理相關的蛋白聚集體 (如 tau、突觸核蛋白) 研究基因表達。

『案例』：結合 FISH 和 IHC 檢測小鼠大腦中淀粉樣斑塊膠質補體表達

補體蛋白可促進阿爾茨海默病 (AD)的神經退行性病變，這類蛋白由包圍 β- 淀粉樣斑塊的膠質細胞分泌。為此，作者提出了一種基于Tyramide-digoxigenin 信號擴增技術的 Aβ 斑塊檢測優化方案 (如圖 4)。該方案結合多重 mRNA 原位熒光雜交 (FISH) 技術，用于檢測 TauPS2APP 小鼠模型中 Aβ 斑塊近端區域膠質細胞特異性的補體表達情況。結果表明，通過信號放大處理，在連續的 FISH-IHC 實驗中可獲得更高的信噪比，并實現對彌漫性 Aβ 斑塊的靈敏檢測 (如圖 5)。

FISH-Flow 技術通過將熒光寡核苷酸與 RNA 雜交，借助流式細胞術實現單細胞層面的熒光定量分析。

『案例』：FISH-Flow 用于定量小鼠和人類細胞中新生和成熟核糖體 RNA。

研究人員開發了一種 FISH-Flow 方法，可用于定量小鼠和人類細胞中新生的 47S rRNA 以及成熟的 18S 和 28S rRNA，該方法還能結合 DNA 染色技術，完成跨細胞周期階段的 rRNA 定量檢測 (如圖 6)。

無論是新生的還是成熟的核糖體 RNA 在細胞中都十分豐富。因此，如圖 7A 所示，針對 rRNA 的 FISH 探針具有較高的信噪比。用 DNA 結合的 DAPI 染料進行染色，可將細胞群體分為 G1/S/G2-M 期，并對細胞周期各階段的 rRNA 進行定量，如圖 7B 所示。

序列熒光原位雜交 (seqFISH，sequential fluorescence in situ hybridization) 是一種生物分子分析方法，將成像技術與組合分子條形碼技術相結合，利用已知序列的探針，對細胞/組織內的全 RNA 做多輪雜交成像，通過分析探針兩臂區域 barcode 的熒光信號組合來判斷基因 ID，講特定位置信息與基因 ID 關聯生成圖像。seqFISH 方法能夠在原生組織和器官環境中獲得高分辨率的細胞類型、狀態、和鄰域關系信息 (圖 8)。

就在今年！諾貝爾化學獎得主 Jennifer Doudna 教授團隊在Nature Biotechnology 期刊發表了題為 “Single-molecule live-cell RNA imaging with CRISPR–Csm" 的研究論文。該團隊開發出一種單分子活細胞熒光原位雜交技術 (Single-molecule live-cell fluorescence in situ hybridization，smLiveFISH)。

如圖所示，GFP 標記的 Csm 復合物標記單個 NOTCH2 mRNA (圖 10 a 和 b 左圖)，smFISH 探針標記 NOTCH2 mRNA (圖 10 a 和 b 中圖)，兩者的疊加圖像顯示共定位情況 (圖 10 a 和 b 右圖)。Csm 復合物病灶與 smFISH 病灶的共定位比例、以及具有 Csm 復合物標記病灶的轉染細胞比例均可進行量化 (圖 10c-d)。

通過雙色成像驗證，Csm 復合物成功標記內源性 NOTCH2 mRNA，并在多種細胞類型中實現穩健檢測，且未對 mRNA 的穩定性、衰變速率、定位及蛋白質表達產生影響。此外，smLiveFISH 技術也成功標記 MAP1B mRNA，通過共定位實驗驗證了信號的準確性，同時揭示其在細胞外圍富集的空間分布特征，且同樣未干擾 mRNA 的穩定性、衰變速率、定位及蛋白質表達，進一步證明該技術適用于不同 RNA 分子的可視化研究。

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參考文獻：

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