以藥找靶，即已知藥物具有活性，尋找藥物作用靶點，其核心思路是利用已知的藥物或活性分子作為探針，從復雜的生物體系中釣取其直接作用的蛋白質靶點。這種方法在闡明老藥新用機制、探索天然產物作用靶點等研究領域中至關重要。

計算機預測通常利用數據挖掘、藥效團模型匹配、正反分子對接技術和藥物-靶標相似性算法等，識別小分子可能作用的靶點。下面是一些常用的靶標預測網站，有需可參考喔~

表 1. 常用的靶標預測網站。

反向分子對接 (Reverse Docking)：將小分子藥物對一個包含數千甚至數萬個蛋白質結構的數據庫進行全局“對接"，根據計算出的結合親和力排序，預測最可能的結合靶點。

• 早期的方法主要依靠結構相似性匹配，而最新的進展是利用如 HelixFold3 或 AlphaFold3 等結構預測模型，在統一的框架內同時模擬蛋白折疊和小分子對接，顯著提升了預測的準確性。

例如，研究者通過設置對接及相似性比較兩條平行路徑共同實現 B. pinnatum 提取物化合物 1 (槲皮素糖苷) 的潛在靶點確定^[1]。

在對接路徑上，研究者通過 PDB 數據庫構建了一個超過 9K 個蛋白的靶點配體數據庫，使用 MarvinSketch 構建槲皮素糖苷的三維結構。為簡化篩選流程，首先使用槲皮素糖苷的母核槲皮素與超過 9000 個蛋白靶點的配體數據庫進行粗篩，以快速得到能足夠容納槲皮素糖苷口的潛在蛋白。隨后選取粗篩 Top50 的潛在作用靶點與槲皮素糖苷進行逐一對接篩選，發現其中 TOP5 的靶點中有兩個與抗炎抗氧化相關的關鍵 PDE 家族成員 PDE10A2 和 PDE4B，其中 PDE4B 抑制劑因其抗炎作用而廣為人知。

另一種路徑是基于 SwissSimilality 的配體相似性比較，通過將槲皮素糖苷與篩選藥物和生物活性使用 2D 分子指紋、超位置和快速非超位置等六種不同的方法進行預測潛在的 3D 相似性分子，發現其與同為 PDE 家族成員的 PDE5A1 酶內的共結晶配體的相似度為 0.952。推測槲皮素糖苷與 PDE5A1 具有活性。

表 2. 計算機反向找靶的靶點信息^[1]。

實驗找靶常用的方法主要有 DARTS、SPR 和 Pulldown 技術等，詳見往期：以藥找靶: 探索活性分子發揮效應的 "神秘" 機制。二者結合使用往往能取得最佳效果。

道理很簡單，對比疾病人群的臨床樣本與正常對照，篩選出疾病發生發展過程中表達水平或功能發生顯著改變的關鍵生物分子，如蛋白質、差異基因等。這些生物分子可以作為后續藥物研究的潛在疾病靶點。

下面我們結合發表于 Science Translational Medicine，題為 “A genome-wide in vivo CRISPR activation screen identifies BACE1 as a therapeutic vulnerability of lung cancer brain metastasis" 的文獻，一起來感受下該方法在科研中的實際應用^[2]。

臨床樣本并不是拿過來就能直接用的！

拿癌癥舉例，通常是采集患者的原代瘤體樣本，也就是從患者體內直接切除下來的新鮮組織，接著提取出腫瘤細胞，種植到免疫缺陷的小鼠體內，讓腫瘤在小鼠體內繁衍生長。——即：患者來源異種移植瘤 (PDX) 。然后再從小鼠體內的腫瘤中提取細胞，在實驗室的器皿中培養，最終形成了用來做科研實驗的穩定細胞系。該細胞系能夠高度還原患者原本的腫瘤特征，是科研研究和測試新藥的寶貴材料^[3]。

該文獻案例中，作者使用的源自原代 LUAD 患者細胞系 CRUK0748-XCL，就是來源于 TRACERx 研究中的患者來源異種移植瘤。

圖 1. 肺癌 TRACERx 研究中 PDX 模型構建和擴增的研究方案示意圖^[4]。

CRISPR 全基因組篩選是一種高通量功能基因組學技術，利用 CRISPR/Cas 系統 (通常為 CRISPR-Cas9) 的基因編輯功能實現基因敲除、敲入、激活和干擾。將CRISPR系統應用于構建基因組文庫——構建全基因組 CRISPR 敲除 (CRISPRko)、干擾 (CRISPRi) 和激活 (CRISPRa) 文庫——進行高通量篩選，是疾病 (尤其是腫瘤) 靶基因研究的主要策略，廣泛應用于包括細胞系、小鼠和斑馬魚在內的多種模型中。

CRISPR 文庫多使用混合文庫形式進行高通量篩選。其操作流程主要包括設計合成 sgRNA 文庫、Cas9 細胞系的構建、表型選擇、高通量測序、生物信息學分析、候選基因和脫靶效應的驗證等 (圖 3)^[4]。

圖 2. CRISPR/Cas9 高通量篩選流程^[4]。

CRISPR/Cas9 技術可實現全基因組范圍的高通量篩選，其針對每個基因設計 3~10 條 sgRNA，利用芯片一次合成數萬條覆蓋整個基因組的 sgRNA 庫，經慢病毒包裝后以低感染復數感染宿主細胞，在適當的篩選條件下測試篩選前后 sgRNA 的豐度變化，進而找出候選基因。

該文獻案例中，作者使用的是“人 Calabrese 全基因組 CRISPRa 文庫"，篩選能夠增強原位肺腺癌 (LUAD) 腫瘤腦轉移的基因。

——腫瘤轉移通常不是因為某個基因丟失了，而是因為某些原本不該表達的基因被異常激活、高表達，從而賦予了癌細胞侵襲和跨越屏障的能力。

• Calabrese 文庫通過 CRISPRa 技術，強行上調人體 18,000 多個編碼基因的表達。賦予癌細胞“新的超能力"： 比如，某個肺癌細胞平時不具備穿透血腦屏障的能力，但文庫恰好激活了它體內的某個基質金屬蛋白酶基因，該細胞就突然獲得了“通關"能力。

• CRISPRa 系統的運作包含兩部分：sgRNA (“導航地圖") 和 dCas9-轉錄激活因子 (“執行機器") ； Calabrese 文庫只有針對全基因組的 sgRNA 序列 (當然，也可以抗性篩選標記如 Puromycin，常用于尋找潛在的“耐藥基因")。

dCas9-VP64 融合蛋白，需要細胞系預表達。該文獻案例中，作者將 CRUK0748-XCL 細胞系改造為 CRUK0748-XCL-GLD 細胞，使其表達催化失活的 dCas9 與 VP64 融合的蛋白 (用于激活基因轉錄) 、GFP 和熒光素酶 (用于體內追蹤)。

簡單來說：使用了一種“沒有剪切活性"的突變 Cas9 蛋白 (稱為 dCas9) 。在 dCas9 上連了一些“轉錄激活因子" (如 VP64、p65、HSF1) 。當它被向導 RNA (sgRNA) 帶到基因的啟動子區域時，它不剪斷 DNA，而是像一個放大器一樣，招募細胞自身的轉錄機器，從而強烈提高目標基因的表達量。

作者將 CRUK0748-XCL-GLD 細胞以 0.3 的 MOI 進行轉染，并篩選至最終文庫覆蓋度為 500 倍。隨后經開胸手術，將轉染文庫的細胞直接接種到 30 只 NSG 小鼠的肺部 (圖 3) 。

圖 3. 體內 CRISPR 激活篩選示意圖^[5]。

通過生物發光成像追蹤腫瘤負荷，終點對肺和腦組織進行 sgRNA 測序并比較其富集程度，結合 TCGA 與 DepMap 數據庫篩選出 12 個候選基因，其中 BACE1 的 sgRNA 在大腦中富集超過 150 倍。

隨后通過獨立 sgRNA 驗證、組織微陣列及臨床樣本分析發現，BACE1 表達增加會增強 LUAD 的骨髓轉移 (圖 4) 。此外，在 BACE1 過表達的肺腫瘤小鼠的肝臟和骨骼中，轉移負荷均有所增加。

圖 4. 使用兩種獨立的 sgRNA 激活 BACE1 表達可增加腦轉移腫瘤負荷^[5]。

【文獻案例】Targeting ATR signaling in sarcoma with homologous recombination deficiency

【使用文庫】MCE 定制庫，包含 71 種藥物，涵蓋用于探索性研究和臨床批準的靶向藥物，以及臨床上用于肉瘤患者治療的一線和二線化療藥物^[6]。

通過構建包含 71 種靶向及化療藥物的化合物庫，在患者來源的肉瘤 3D 細胞模型中開展中通量藥物篩選 (基于 AUC 與 IC₅₀ 綜合評估) ，成功鑒定出以 ATR、CHK1、WEE1 抑制劑為代表的 DNA 損傷應答 (DDR) 通路關鍵活性化合物。進一步通過聯合用藥篩選發現 ATR 抑制劑 (如 Camonsertib) 與 PARP 抑制劑或化療藥物 (如 Doxorubicin) 具有顯著協同效應。

機制研究表明，這類化合物通過抑制 ATR-CHK1 信號軸，導致 DNA 復制叉減速、復制壓力累積及 DNA 損傷增加，進而引發有絲分裂異常和細胞凋亡；同時，同源重組缺陷 (HRD) 高表達腫瘤中 ATR 信號通路本身顯著上調，揭示了“藥物篩選命中化合物—作用于關鍵靶點—靶點依賴驅動疾病"的完整作用邏輯鏈。

以藥找靶，即已知藥物具有活性，尋找藥物作用靶點，其核心思路是利用已知的藥物或活性分子作為探針，從復雜的生物體系中釣取其直接作用的蛋白質靶點。這種方法在闡明老藥新用機制、探索天然產物作用靶點等研究領域中至關重要。

計算機預測通常利用數據挖掘、藥效團模型匹配、正反分子對接技術和藥物-靶標相似性算法等，識別小分子可能作用的靶點。下面是一些常用的靶標預測網站，有需可參考喔~

表 1. 常用的靶標預測網站。

反向分子對接 (Reverse Docking)：將小分子藥物對一個包含數千甚至數萬個蛋白質結構的數據庫進行全局“對接"，根據計算出的結合親和力排序，預測最可能的結合靶點。

• 早期的方法主要依靠結構相似性匹配，而最新的進展是利用如 HelixFold3 或 AlphaFold3 等結構預測模型，在統一的框架內同時模擬蛋白折疊和小分子對接，顯著提升了預測的準確性。

例如，研究者通過設置對接及相似性比較兩條平行路徑共同實現 B. pinnatum 提取物化合物 1 (槲皮素糖苷) 的潛在靶點確定^[1]。

在對接路徑上，研究者通過 PDB 數據庫構建了一個超過 9K 個蛋白的靶點配體數據庫，使用 MarvinSketch 構建槲皮素糖苷的三維結構。為簡化篩選流程，首先使用槲皮素糖苷的母核槲皮素與超過 9000 個蛋白靶點的配體數據庫進行粗篩，以快速得到能足夠容納槲皮素糖苷口的潛在蛋白。隨后選取粗篩 Top50 的潛在作用靶點與槲皮素糖苷進行逐一對接篩選，發現其中 TOP5 的靶點中有兩個與抗炎抗氧化相關的關鍵 PDE 家族成員 PDE10A2 和 PDE4B，其中 PDE4B 抑制劑因其抗炎作用而廣為人知。

另一種路徑是基于 SwissSimilality 的配體相似性比較，通過將槲皮素糖苷與篩選藥物和生物活性使用 2D 分子指紋、超位置和快速非超位置等六種不同的方法進行預測潛在的 3D 相似性分子，發現其與同為 PDE 家族成員的 PDE5A1 酶內的共結晶配體的相似度為 0.952。推測槲皮素糖苷與 PDE5A1 具有活性。

表 2. 計算機反向找靶的靶點信息^[1]。

實驗找靶常用的方法主要有 DARTS、SPR 和 Pulldown 技術等，詳見往期：以藥找靶: 探索活性分子發揮效應的 "神秘" 機制。二者結合使用往往能取得最佳效果。

道理很簡單，對比疾病人群的臨床樣本與正常對照，篩選出疾病發生發展過程中表達水平或功能發生顯著改變的關鍵生物分子，如蛋白質、差異基因等。這些生物分子可以作為后續藥物研究的潛在疾病靶點。

下面我們結合發表于 Science Translational Medicine，題為 “A genome-wide in vivo CRISPR activation screen identifies BACE1 as a therapeutic vulnerability of lung cancer brain metastasis" 的文獻，一起來感受下該方法在科研中的實際應用^[2]。

臨床樣本并不是拿過來就能直接用的！

拿癌癥舉例，通常是采集患者的原代瘤體樣本，也就是從患者體內直接切除下來的新鮮組織，接著提取出腫瘤細胞，種植到免疫缺陷的小鼠體內，讓腫瘤在小鼠體內繁衍生長。——即：患者來源異種移植瘤 (PDX) 。然后再從小鼠體內的腫瘤中提取細胞，在實驗室的器皿中培養，最終形成了用來做科研實驗的穩定細胞系。該細胞系能夠高度還原患者原本的腫瘤特征，是科研研究和測試新藥的寶貴材料^[3]。

該文獻案例中，作者使用的源自原代 LUAD 患者細胞系 CRUK0748-XCL，就是來源于 TRACERx 研究中的患者來源異種移植瘤。

圖 1. 肺癌 TRACERx 研究中 PDX 模型構建和擴增的研究方案示意圖^[4]。

CRISPR 全基因組篩選是一種高通量功能基因組學技術，利用 CRISPR/Cas 系統 (通常為 CRISPR-Cas9) 的基因編輯功能實現基因敲除、敲入、激活和干擾。將CRISPR系統應用于構建基因組文庫——構建全基因組 CRISPR 敲除 (CRISPRko)、干擾 (CRISPRi) 和激活 (CRISPRa) 文庫——進行高通量篩選，是疾病 (尤其是腫瘤) 靶基因研究的主要策略，廣泛應用于包括細胞系、小鼠和斑馬魚在內的多種模型中。

CRISPR 文庫多使用混合文庫形式進行高通量篩選。其操作流程主要包括設計合成 sgRNA 文庫、Cas9 細胞系的構建、表型選擇、高通量測序、生物信息學分析、候選基因和脫靶效應的驗證等 (圖 3)^[4]。

圖 2. CRISPR/Cas9 高通量篩選流程^[4]。

CRISPR/Cas9 技術可實現全基因組范圍的高通量篩選，其針對每個基因設計 3~10 條 sgRNA，利用芯片一次合成數萬條覆蓋整個基因組的 sgRNA 庫，經慢病毒包裝后以低感染復數感染宿主細胞，在適當的篩選條件下測試篩選前后 sgRNA 的豐度變化，進而找出候選基因。

該文獻案例中，作者使用的是“人 Calabrese 全基因組 CRISPRa 文庫"，篩選能夠增強原位肺腺癌 (LUAD) 腫瘤腦轉移的基因。

——腫瘤轉移通常不是因為某個基因丟失了，而是因為某些原本不該表達的基因被異常激活、高表達，從而賦予了癌細胞侵襲和跨越屏障的能力。

• Calabrese 文庫通過 CRISPRa 技術，強行上調人體 18,000 多個編碼基因的表達。賦予癌細胞“新的超能力"： 比如，某個肺癌細胞平時不具備穿透血腦屏障的能力，但文庫恰好激活了它體內的某個基質金屬蛋白酶基因，該細胞就突然獲得了“通關"能力。

• CRISPRa 系統的運作包含兩部分：sgRNA (“導航地圖") 和 dCas9-轉錄激活因子 (“執行機器") ； Calabrese 文庫只有針對全基因組的 sgRNA 序列 (當然，也可以抗性篩選標記如 Puromycin，常用于尋找潛在的“耐藥基因")。

dCas9-VP64 融合蛋白，需要細胞系預表達。該文獻案例中，作者將 CRUK0748-XCL 細胞系改造為 CRUK0748-XCL-GLD 細胞，使其表達催化失活的 dCas9 與 VP64 融合的蛋白 (用于激活基因轉錄) 、GFP 和熒光素酶 (用于體內追蹤)。

簡單來說：使用了一種“沒有剪切活性"的突變 Cas9 蛋白 (稱為 dCas9) 。在 dCas9 上連了一些“轉錄激活因子" (如 VP64、p65、HSF1) 。當它被向導 RNA (sgRNA) 帶到基因的啟動子區域時，它不剪斷 DNA，而是像一個放大器一樣，招募細胞自身的轉錄機器，從而強烈提高目標基因的表達量。

作者將 CRUK0748-XCL-GLD 細胞以 0.3 的 MOI 進行轉染，并篩選至最終文庫覆蓋度為 500 倍。隨后經開胸手術，將轉染文庫的細胞直接接種到 30 只 NSG 小鼠的肺部 (圖 3) 。

圖 3. 體內 CRISPR 激活篩選示意圖^[5]。

通過生物發光成像追蹤腫瘤負荷，終點對肺和腦組織進行 sgRNA 測序并比較其富集程度，結合 TCGA 與 DepMap 數據庫篩選出 12 個候選基因，其中 BACE1 的 sgRNA 在大腦中富集超過 150 倍。

隨后通過獨立 sgRNA 驗證、組織微陣列及臨床樣本分析發現，BACE1 表達增加會增強 LUAD 的骨髓轉移 (圖 4) 。此外，在 BACE1 過表達的肺腫瘤小鼠的肝臟和骨骼中，轉移負荷均有所增加。

圖 4. 使用兩種獨立的 sgRNA 激活 BACE1 表達可增加腦轉移腫瘤負荷^[5]。

【文獻案例】Targeting ATR signaling in sarcoma with homologous recombination deficiency

【使用文庫】MCE 定制庫，包含 71 種藥物，涵蓋用于探索性研究和臨床批準的靶向藥物，以及臨床上用于肉瘤患者治療的一線和二線化療藥物^[6]。

通過構建包含 71 種靶向及化療藥物的化合物庫，在患者來源的肉瘤 3D 細胞模型中開展中通量藥物篩選 (基于 AUC 與 IC₅₀ 綜合評估) ，成功鑒定出以 ATR、CHK1、WEE1 抑制劑為代表的 DNA 損傷應答 (DDR) 通路關鍵活性化合物。進一步通過聯合用藥篩選發現 ATR 抑制劑 (如 Camonsertib) 與 PARP 抑制劑或化療藥物 (如 Doxorubicin) 具有顯著協同效應。

機制研究表明，這類化合物通過抑制 ATR-CHK1 信號軸，導致 DNA 復制叉減速、復制壓力累積及 DNA 損傷增加，進而引發有絲分裂異常和細胞凋亡；同時，同源重組缺陷 (HRD) 高表達腫瘤中 ATR 信號通路本身顯著上調，揭示了“藥物篩選命中化合物—作用于關鍵靶點—靶點依賴驅動疾病"的完整作用邏輯鏈。

               

產品推薦

計算機反向找靶

反向找靶，也被稱為靶點篩選、反向找靶、靶點垂釣等，是新藥研發和老藥新用的關鍵環節，目的是識別藥物發揮調控作用的核心生物靶點，為新藥開發和現有藥物的再利用提供重要方向。

分子動力學模擬

一種計算機模擬方法，用于研究分子體系的運動和相互作用、預測分子體系的行為和結構性質。通過計算機分子模擬，能夠在分子水平上理解生物大分子的運動與生物功能、蛋白-小分子之間相互作用機理。

分子對接

一種基于計算模擬的藥物分子與生物大分子（如蛋白質、核酸等）相互作用預測技術。其核心原理包括鎖鑰模型和誘導契合學說，分別描述配體-受體的剛性匹配和動態構象調整過程。

虛擬篩選

虛擬篩選是基于小分子數據庫開展的活性化合物篩選。利用小分子化合物與藥物靶標間的分子對接運算，虛擬篩選可快速從幾十至上百萬分子中，遴選出具有成藥性的活性化合物，大大降低實驗篩選化合物數量，縮短研究周期，降低藥物研發的成本。

AI 藥物篩選

人工智能藥物篩選是一種結合 AI 技術與計算化學的高通量篩選方法，廣泛應用于蛋白結構預測、新藥研發和分子設計與優化等領域。

參考文獻

[1] Louren?o E M G, et al. Identification of a selective PDE4B inhibitor from Bryophyllum pinnatum by target fishing study and in vitro evaluation of quercetin 3-O-α-L-arabinopyranosyl-(1→ 2)-O-α-L-rhamnopyranoside[J]. Frontiers in pharmacology, 2020, 10: 1582.

[2] Chafe S C, et al. A genome-wide in vivo CRISPR activation screen identifies BACE1 as a therapeutic vulnerability of lung cancer brain metastasis[J]. Science translational medicine, 2025, 17(805): eadu2459.

[3] Olson B, et al. Mouse Models for Cancer Immunotherapy Research. Cancer Discov. 2018 Nov;8(11):1358-1365.

[4] Hynds RE, et al. Representation of genomic intratumor heterogeneity in multi-region non-small cell lung cancer patient-derived xenograft models. Nat Commun. 2024 May 31;15(1):4653.

[5] Lei T, et al. [Development and applications of CRISPR/Cas9 library screening technology in cancer research]. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 2019 Nov 30;39(11):1381-1386. Chinese. 

[6] Planas-Paz L, et al. Targeting ATR signaling in sarcoma with homologous recombination deficiency. Cancer Lett. 2026 Apr 1;642:218300.