MedChemExpre...

查看電話 在線咨詢

立即詢價

您提交后，專屬客服將第一時間為您服務

點擊提交代表您同意《用戶服務協議》《隱私政策》

細胞 ATP 檢測和活體腫瘤示蹤，共用一套雙熒光素酶體系嗎？

閱讀：77 發布時間：2026-7-7

Section.01

什么是雙熒光素酶實驗？

雙熒光素酶實驗 (Dual-Luciferase Reporter Assay) 是一種廣泛應用于分子生物學的經典實驗技術，主要用于定量檢測基因表達水平以及驗證生物大分子之間的相互作用 (如 miRNA 與靶基因、轉錄因子與啟動子)。

核心原理

該實驗利用熒光素酶基因轉染到細胞中，通過檢測其產生的熒光素酶活性 (“生物發光") 來量化目標基因的表達水平。實驗中會同時使用兩種熒光素酶：螢火蟲熒光素酶 (Firefly Luciferase, F-Luc) 和海腎熒光素酶 (Renilla Luciferase, R-Luc)。

『報告基因 (F-Luc)』

將你感興趣的調控元件(如啟動子、基因的 3'-UTR 區域)克隆到螢火蟲熒光素酶基因的上下游。當調控元件被激活或靶向結合時，發光的強度會發生變化。

『內參基因 (R-Luc)』

作為對照。由于細胞數量、轉染效率等外在因素會影響實驗的絕對發光值，海腎熒光素酶作為一個穩定的基礎參照，可以用來校正這些誤差。

在 ATP 和熒光素酶存在下，D-熒光素 (D-Luciferin) 能夠被氧化，發出波長為 570 nm 左右的生物螢光 (圖 1)。當熒光素過量時，發光亮度與熒光素酶濃度呈正相關，廣泛用于熒光素酶報告基因的檢測。

圖 1. D-熒光素發光原理。

在 O₂ 存在條件下，海腎熒光素酶可以將腔腸熒光素 (coelenterazine) 氧化成腔腸酰胺 (coelenteramide)，并發出波長為 480 nm 左右的生物螢光 (圖 2)。海腎熒光素酶作為雙熒光素酶報告基因的內參，消除了細胞生長狀態、數量、轉染效率等差異的影響，使得檢測結果的準確性更高。

圖 2. 腔腸素發光原理。

核心應用

高通量篩選 (HTS)：基于熒光素酶的高靈敏度，科學家可以快速篩選靶向化合物。隨后可通過正交實驗 (如基于同一底物的 ATP 檢測法) 來排除假陽性，從而確認藥物的真實靶點結合能力與生物學活性。
動物活體成像 (IVIS)：利用活體成像儀可無創、實時、動態地追蹤動物體內的目標細胞 (如腫瘤細胞或免疫細胞) 生長、轉移以及對藥物的響應。這一活體水平的數據，通常與離體細胞的 ATP 代謝水平檢測及熒光素酶定量分析相結合，實現從“宏觀整體 (活體) "到“微觀局部 (體外) "的多維度相互印證。
腫瘤藥物研發：在評估抗腫瘤藥效時，活體成像不僅能追蹤瘤體大小變化，由于螢火蟲熒光素酶發光嚴格依賴于 ATP，它還能通過 ATP 的豐度變化來直觀反映活細胞的代謝活躍度以及藥物殺傷機制。
基因治療：在監測基因遞送效率 (如 mRNA 或 siRNA 遞送) 時，科學家常將熒光素酶基因作為報告基因，通過檢測熒光素酶活性水平來評估基因的表達強度，并借此比對不同遞送載體的轉染效率。

雙熒光素酶實驗在基因調控、蛋白互作及藥物篩選等領域提供了很大的技術支持，有力推動了生物醫學研究與藥物開發進程^[1]。本期我們就來聊聊雙熒光素酶實驗的那些事兒~

Section.02

雙熒光素酶報告基因檢測

(分子水平)

實驗步驟^[2][3][4]

(1) 將雙熒光報告基因構建入不同質?；蛲毁|粒中。

(2) 將質粒轉染入目標細胞。

(3) 細胞培養一天后以冰冷 PBS 清洗一遍，加入 80-100 µL lysis buffer。

(4) 冰上被動裂解 30 min。

(5) 4℃，12000 rpm 離心 10 min。

(6) 吸取上清 10 µL 于 luciferase 專用 96 孔板。

(7) 依次加入 50 µL Firefly Luciferase Buffer (FB) 與 50 µL Renilla Luciferase Buffer (RB)。

(8) 酶標儀檢測 550-570 nm 和 480 nm 的熒光強度。

注意事項

(1) 需加入足量底物，保證底物的飽和，否則會造成檢測結果出現很大偏差。

(2) 室溫反應。反應時各個組分 (細胞裂解產物，底物工作液等) 都需要調整到室溫。

(3) 熒光素酶的半衰期一般約 30 min，加完底物后可立即檢測，盡量在 30 min內完成。

(4) 底物避光密封保存，螢火蟲熒光素酶底物 -20℃ 保存；海腎熒光素酶底物推薦 -80℃ 保存。

(5) 熒光素酶報告基因實驗的檢測結果非常靈敏，復孔之間的數值有一定差異是正常的。

表1. 實驗常見問題及分析。

Section.03

利用螢火蟲熒光素酶

進行 ATP 檢測

(細胞水平)

細胞內 ATP 活性測定：檢測細胞活力

『1. 標準曲線』

建立 ATP 濃度和發光強度的標準曲線^[8](可選)

(1) 細胞準備：將 HEK293-pmeLUC 細胞種在 24 孔板中 (7×10⁴ 細胞/孔)，培養 24 小時。

(2) IVIS 初始化：啟動 IVIS 成像儀，冷卻至 -90℃，設置曝光時間 1 分鐘、Binning 4、光圈 F/STOP=1，選擇熒光和照片疊加模式。

(3) 發光測量：每孔加入 8 µL 的 D-熒光素 (15 mg/mL)，等待 3 分鐘，然后采集發光圖像。

(4) 建立標準曲線：在細胞孔中加入不同濃度的 ATP (1-1000 μM)，輕輕混勻，再次采集發光圖像。

(5) 可選對照：加入 5U 的 apyrase (一種 ATP 水解酶)，發光應都消失，證明信號確實來自 ATP。

(6) 圖像處理：用 Living Image 軟件圈出每個孔的興趣區域 (ROI)，導出 “Total Flux"(光子/秒)，扣除背景，繪制 ATP 濃度 vs. 發光強度的標準曲線，并得到趨勢線方程。

『2. ATP 檢測』

以 3D Cell-ATP Viability Detection Kit 為例

(1) 試劑準備：按照 96 孔板 (每孔 100 μL 細胞培養基) 加入 100 μL 細胞活力檢測試劑的量，即 V 細胞：V 細胞活力檢測試劑 = 1:1，取適量本產品解凍后平衡至室溫。

注：本品解凍后建議適當分裝，避免反復凍融。

(2) 細胞活力檢測：取出待檢測的細胞培養板，室溫平衡 30 min。

(3) 每孔加入 100 μL 活力檢測試劑，室溫振蕩混勻 5 min 以促進細胞充分裂解。

(4) 將細胞培養皿室溫孵育 25 min，使發光信號趨于穩定。

(5) 使用具有檢測化學發光功能的多功能酶標儀進行化學發光測定，記錄發光值，每個孔的檢測時間一般為 0.25-1 s。

注意事項

(1) 具體參數可根據儀器類型及檢測靈敏度進行適當調整。

(2) 活力檢測試劑滲透進入 3D 細胞及發光信號趨于穩定的時間與細胞種類、培養時間、3D 細胞團大小均有關，可以通過使用移液器反復吹打來替代振蕩操作。

(3) 可以在加入活力檢測試劑，振蕩 5 min，孵育 5 min 后直接開始檢測，每隔 5min 檢測收集一次發光值，取發光信號趨于穩定的時間點對應發光值作為實驗數據。

(4) 檢測效果因細胞的種類不同而異，對于一些 ATP 含量特別高的細胞，在細胞數量達到 100,000 以上可能會出現化學發光讀數繼續升高，但喪失線性關系。

Section.04

動物活體成像實驗

(動物水平)

實驗原理

熒光素所發的光很容易透過組織，在體內代謝較慢，而且特異性好。所以大部分活體成像實驗采用螢火蟲熒光素酶基因作為報告基因。

哺乳動物發熒光，一般是將螢火蟲熒光素酶 (firefly luciferase) 基因整合到被觀察細胞染色體的 DNA 上，讓細胞表達熒光素酶，培養出能穩定持續表達熒光素酶的細胞株，當細胞分裂、分化時，熒光素酶也會得到表達。標記后的熒光素酶在活細胞內會產生發光現象，且發光強度與標記細胞的數目呈線性相關^[5][6]。

圖 3. 體內成像系統監測腫瘤生長^[7]。

實驗步驟^[6]

(1) 通過尾靜脈注射熒光素酶標記的 1 × 10⁶ 個 MOLM-13-Luc 細胞到小鼠體內，建立腫瘤模型。

(2) 接種后，待腫瘤生長 6 天后，開始每日灌胃給藥 (定義為治療第 0 天)，劑量為 200 或 400 mg/kg。(這步可以根據自己實際的實驗方案而定)

(3) 采用生物發光成像 (BLI) 技術，使用 IVIS 體內成像系統，通過腹腔注射 150 mg/kg D-熒光素鉀鹽評估腫瘤生長情況。

圖 4. 小鼠體內成像^[6]。

Section.05

常見問題與答疑^{[2][6][9][10][11]}

D-熒光素鈉鹽、D-熒光素、D-熒光素鉀鹽關系是什么？

Luciferin 的常見形式有鈉鹽和鉀鹽，是螢火蟲熒光素酶的底物，兩種鹽的水溶性都很好，且兩者有著相同的化學發光發射波長，在應用上沒有差別。

使用效果：生物活性上是等效的。溶解度不同。

表 2. D-熒光素鈉鹽、D-熒光素、D-熒光素鉀鹽的區別。

D-熒光素和熒光素關系是什么？

兩個產品生物活性上不等效，應用范圍不同。

表 3. D-熒光素和熒光素的區別。

D-熒光素氧化發光的過程需要鎂離子和 ATP，D-熒光素鉀鹽做體外成像的話，ATP 和鎂離子怎么滿足呢？

體外成像時，通常使用添加了 ATP 和鎂離子的細胞培養基來稀釋探針。不過，大多數細胞自身所含的 ATP 和鎂離子已足以支持 D-熒光素底物的反應，但不同細胞類型的內源性含量存在差異。因此，建議先進行預實驗，嘗試使用不額外添加 ATP 和鎂離子的培養基，以評估實際成像效果。

D-熒光素動物實驗什么時候檢測合適？

腹腔注射熒光素后，細胞約 3 分鐘開始發光， 10 分鐘達穩定峰值，持續 10-15 分鐘后衰減，最佳檢測窗口為注射后 10-15 分鐘。注意：建議通過預實驗繪制熒光素酶動力學曲線，以確認實際的很強信號時間和平臺期^[6]。

海腎熒光素酶的作用是什么？

海腎熒光素酶作為雙熒光素酶報告基因的內參，校正細胞生長狀態、數量、轉染效率等差異的影響，使得檢測結果的準確性更高^[10]。

不同熒光素酶有什么區別？

檢測時熒光值過高如何解決？

減少質粒轉染量；細胞樣品裂解后，離心取上清后可適當稀釋后檢測。不建議通過減少底物量來降低熒光值，需要保證底物的飽和來反映熒光素酶真實的表達水平，否則會造成檢測結果出現大的偏差。

產品推薦

D-Luciferin sodium (HY-12591)

熒光素酶 (Luc) 的天然底物

D-Luciferin (HY-12591A)

熒光素酶 (Luc) 的天然底物

D-Luciferin potassium (HY-12591B)

熒光素酶 (Luc) 的天然底物

Coelenterazine (HY-18743)

apoaequorin 和 Renilla 熒光素酶的發光酶底物

3D Cell-ATP Viability Detection Kit (HY-K6017)

通過對 ATP 進行定量以測定培養物中 3D 細胞數目及細胞活力

Renilla-Firefly Luciferase Dual Assay Kit (HY-K1013)

檢測哺乳動物細胞雙螢光素酶報告基因

參考文獻

[1] David S McNabb, et al. Dual Luciferase Assay System for Rapid Assessment of Gene Expression in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot Cell. 2005 Sep;4(9):1539–1549.

[2] Xiaochen Wang, et al. Resistance to anti-LAG-3 plus anti-PD-1 therapy in head and neck cancer is mediated by Sox9+ tumor cells interaction with Fpr1+ neutrophils. Nat Commun. 2025 Apr 28;16(1):3975.

[3] J Stables, et al. Development of a dual glow-signal firefly and Renilla luciferase assay reagent for the analysis of G-protein coupled receptor signalling. J Recept Signal Transduct Res. 1999 Jan-Jul;19(1-4):395-410.

[4] Nina Solberg, et al. Luciferase assay to study the activity of a cloned promoter DNA fragment. Methods Mol Biol. 2013:977:65-78.

[5] Yusuke Inoue, et al. Timing of imaging after d-luciferin injection affects the longitudinal assessment of tumor growth using in vivo bioluminescence imaging. Int J Biomed Imaging. 2010:2010:471408.

[6] Xuejiao Shirley Guo, et al. Prioritization of Eleven-Nineteen-Leukemia Inhibitors as Orally Available Drug Candidates for Acute Myeloid Leukemia. J Med Chem. 2024 Nov 12;67(22):20100–20117.

[7] Doyle K, et al. A Comparison of in vivo Tumor-Homing Abilities of Placental-Derived and Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells in High-Risk Neuroblastoma. J Pediatr Surg. 2025 Jan;60(1):161954.

[8] Giampaolo Morciano, et al. Use of luciferase probes to measure ATP in living cells and animals. Nat Protoc. 2017 Aug;12(8):1542-1562.

[9] Shimin Zong, et al. SIRT3 knockout aggravates LPS-induced eustachian tube dysfunction. J Otol. 2025 Nov 13;20(4):211–218.

[10] Amde Selassie Shifera, et al. Factors modulating expression of Renilla luciferase from control plasmids used in luciferase reporter gene assays. Anal Biochem. Author manuscript; available in PMC: 2011 Jan 15.

[11] Bakhos A Tannous, et al. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring of biological processes in culture and in vivo. Nat Protoc. Author manuscript; available in PMC: 2009 Jul 1.

細胞 ATP 檢測和活體腫瘤示蹤，共用一套雙熒光素酶體系嗎？

會員登錄

收藏該商鋪

提示

細胞 ATP 檢測和活體腫瘤示蹤，共用一套雙熒光素酶體系嗎？

會員登錄

收藏該商鋪

提示

細胞 ATP 檢測和活體腫瘤示蹤，共用一套雙熒光素酶體系嗎？