隨著流式細胞術應用領域的不斷擴展，流式抗體和熒光標記產品的種類和數量也在不斷增加。多色分析實驗的需求不斷上升，導致抗體選擇和熒光標記搭配變得愈加復雜。這些問題對實驗的順利進行構成了挑戰。為了確保流式技術的成功應用，選擇合適的流式抗體是關鍵。科研工作者可以從以下五個方面來篩選最·適合的流式抗體。

1.抗體的基本要求

流式抗體本身也是抗體，所以首先要滿足抗體選擇的最基本條件：

靶標類型：明確靶標是胞內還是胞外蛋白。胞內蛋白需預處理以使抗體進入細胞，而胞外蛋白則直接標記細胞表面。

樣品來源匹配：選擇與樣品來源相匹配的抗體，避免物種間的交叉反應，提高實驗的特異性和準確性。

流式細胞術專用抗體：務必選擇標注為適用于流式細胞術的抗體，以確保其在流式細胞儀中的性能和數據的準確性。

2.流式細胞儀要求

激光配置：確認流式細胞儀上的激光器數量和波長。常見的配置包括 488 nm 和 635 nm 激光器，但一些儀器可能僅裝配一個激光器。因此，即使是相同型號的設備，其激光配置也可能不同，這可能影響你的實驗設計。

濾光片數量：了解儀器配備的濾光片數量，即檢測通道的數量。這決定了你可以同時檢測的參數數量。例如，如果儀器有多個濾光片，你可以同時檢測更多的熒光標記。

儀器型號：確認流式細胞儀的具體型號，有助于了解其檢測通道的配置。不同型號的儀器可能會有不同的通道配置，即使是相同的熒光標記，其在不同儀器上的檢測通道設置也可能有所不同。

3.熒光標記的選擇

在選擇流式細胞術抗體時，建議優先使用直接標記熒光的抗體。相比于間接標記的二抗，直接標記抗體可以減少實驗步驟，避免多次清洗帶來的細胞浪費，并提高實驗的準確性。熒光的強度也會影響結果，根據抗原表達的強弱及分群情況選擇適當的熒光標記。如果抗原表達較弱或分群不明顯，建議使用強熒光如PE，以增強信號；而對于抗原表達強或分群明顯的情況，可以選擇弱熒光如FITC。常見熒光的強度排序為：PE > APC > PE-Cy5 > PerCP-Cy5.5 > FITC。還可以考慮使用新型熒光如Alexa Fluor和eFluor，這些標記物具有更高的亮度、優良的激光穩定性和對pH值的不敏感性。例如，盡管Alexa Fluor 488和FITC使用相同的檢測通道，但Alexa Fluor 488在信號強度和淬滅時間上明顯優于FITC。

4.多色配原則

在流式細胞術中，設計熒光標記方案時應注意以下幾點：

通道選擇：每個檢測通道只能使用一種熒光標記。各通道之間的熒光標記可以自由搭配。例如，如果在FL1通道使用了FITC標記的抗體，那么不能在同一實驗中再選擇Alexa Fluor 488標記的抗體。不過，其他通道的抗體可以選擇PE、APC等不同的標記物進行組合。

熒光重疊：盡量減少熒光素光譜的重疊，以避免補償困難。例如，PE-Cy5與APC的光譜重疊較大，會導致補償問題，建議使用PE-Cy5.5或PerCP-Cy5.5來避免這種情況。常用的四色熒光組合為：FITC、PE、PerCP-Cy5.5、APC。

多色分析：在進行多色分析時，特別是五色以上的實驗，可能會受到熒光標記種類的限制。可以聯系默瑞斯生物給出方案哦~

5.同型對照抗體的選擇

同型對照（Isotype Control）用于消除抗體非特異性結合產生的背景染色，是真正的流式陰性對照。它不僅幫助設定流式細胞儀的電壓，還省去復雜的競爭封閉步驟。

選擇同型對照時，應使用與一抗相同種屬、亞型、亞鏈及熒光標記的免疫球蛋白，并保持劑量一致。熒光一抗的說明書通常會提供對應同型對照的貨號。如果使用純化的一抗加熒光標記的二抗，則應選擇相應的同型對照抗體，例如，純化CD3+PE標記的二抗樣品管應使用純化的同型對照加PE標記的二抗作為對照。對于細胞表面或胞內抗原表達低且類似抗原眾多的情況，同型對照可能因非特異性結合而導致較高表達，此時推薦使用空白對照等其他陰性對照。不熟悉流式操作或檢測胞內因子時，建議使用同型對照；而熟悉操作且了解抗體表達的用戶可以考慮省略同型對照。

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