小鼠 GDF-15 ELISA 檢測試劑盒實(shí)操攻略

　　一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

　　試劑盒組分核對?

　　確認(rèn)酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品、檢測抗體、HRP親和素、各類稀釋液、洗滌液、TMB底物、終止液等組分齊全，未過有效期。

　　耗材與設(shè)備準(zhǔn)備?

　　準(zhǔn)備酶標(biāo)儀、離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、多通道移液器、一次性吸頭、封板膜等，提前校準(zhǔn)移液器。

　　試劑預(yù)平衡?

　　所有試劑從2-8℃取出，室溫平衡15-30分鐘;濃縮洗滌液若有結(jié)晶，37℃水浴溶解后按說明書比例稀釋。

　　二、樣本處理與保存

　　血清/血漿樣本?

　　用無熱原無內(nèi)毒素試管收集，避免溶血，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘分離上清，48小時(shí)內(nèi)檢測，長期保存分裝后-20℃凍存，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

　　組織勻漿樣本?

　　用PBS沖洗組織去除多余血液，剪為1-2mm碎塊，按1g組織加10ml裂解液的比例勻漿，5000×g離心5分鐘，取上清檢測或分裝凍存。

　　細(xì)胞上清/尿液樣本?

　　細(xì)胞上清3000轉(zhuǎn)離心去除顆粒，尿液樣本離心后可直接使用，4℃暫存不超過48小時(shí)。

　　三、標(biāo)準(zhǔn)品配制

　　凍干標(biāo)準(zhǔn)品加入1ml標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，靜置5分鐘后輕柔渦旋，配成1000pg/ml的母液。

　　按倍比梯度依次稀釋出1000、500、250、125、62.5pg/ml等系列濃度，空白孔僅加稀釋液，每次實(shí)驗(yàn)需新鮮配制標(biāo)準(zhǔn)品并重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

　　四、操作流程

　　加樣孵育?

　　每孔加入50μL標(biāo)準(zhǔn)品或處理好的樣本，建議做雙孔減少誤差;加入50μL抗體混合液，室溫孵育1小時(shí)。

　　洗板操作?

　　每孔用350μL 1×洗滌液清洗3次，每次洗板后在濾紙上拍干，全程避免酶標(biāo)板干燥。

　　顯色終止?

　　每孔加入100μL TMB顯色液，37℃暗處孵育10-20分鐘，待標(biāo)準(zhǔn)品梯度顯色明顯后，立即加入100μL終止液，溶液由藍(lán)變黃。

　　讀數(shù)計(jì)算?

　　30分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定OD值，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，要求相關(guān)系數(shù)R≥0.9900，根據(jù)樣本OD值換算出對應(yīng)濃度，再乘以樣本稀釋倍數(shù)得到最終結(jié)果。

　　五、關(guān)鍵避坑指南

　　無顯色/顯色極弱?

　　檢查試劑有效期，嚴(yán)禁混用不同批號(hào)試劑盒，確認(rèn)孵育溫度和時(shí)間符合要求，排查是否漏加HRP相關(guān)試劑。

　　背景值過高?

　　用洗板機(jī)充分洗板，校準(zhǔn)移液器保證加樣量準(zhǔn)確，每步使用新的封板膜，避免HRP殘留。

　　結(jié)果重復(fù)性差(CV值過高)?

　　實(shí)驗(yàn)全程用封板膜封口防止酶標(biāo)板干燥，定期校準(zhǔn)移液器，吸頭一次性使用，避免交叉污染。

　　其他注意事項(xiàng)?

　　操作時(shí)避免皮膚和眼睛直接接觸終止液與TMB底物，所有實(shí)驗(yàn)廢棄物按傳染物規(guī)范處理。

　　注：以上科研產(chǎn)品資料供參考!

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