一、實驗準備

 

　　1.動物準備：選擇健康成年動物，術前禁食不禁水12至16小時，以減少肝糖原對細胞分離的干擾。

 

　　2.溶液配制：準備灌注緩沖液，通常為無鈣Hanks平衡鹽溶液或EGTA溶液，用于螯合鈣離子，破壞細胞間連接；另配制含膠原酶的消化液，使用含鈣的Hanks或WilliamsE培養基作為溶劑，膠原酶濃度根據動物種屬和肝健康狀況確定，一般范圍為0.05%至0.1%。所有溶液需預熱至37攝氏度，并調節pH至7.4。

 

　　3.器械與耗材：準備手術剪、鑷子、血管夾、靜脈留置針、蠕動泵或注射泵、無菌注射器、細胞過濾器（孔徑100至200微米）、離心管、培養皿等。

 

　　二、灌注操作步驟

 

　　1.動物麻醉與固定：采用適宜麻醉方法使動物進入深度麻醉狀態，仰臥位固定，腹部充分暴露并消毒。

 

　　2.開腹與門靜脈插管：沿腹正中線切開皮膚及肌肉，翻開肝臟，暴露門靜脈主干。小心分離門靜脈周圍組織，在遠端放置血管夾暫時阻斷血流，近端剪一小口，插入留置針并結扎固定，松開血管夾后連接灌注裝置。灌注流速根據動物體重調整，通常為5至10毫升每分鐘。

 

　　3.預灌注：開啟灌注泵，以預熱的灌注緩沖液經門靜脈沖洗肝臟。同時剪開肝下下腔靜脈或胸段下腔靜脈作為流出通道。預灌注持續約5至10分鐘，直至肝臟顏色由暗紅變為土黃，表明血液被清除。

 

　　4.原位消化灌注：關閉流出通道，停止預灌注，轉換至膠原酶消化液。繼續灌注3至8分鐘，期間肝臟會逐漸膨脹、表面出現裂隙或凹陷，質地變軟。消化終點可通過輕觸肝臟表面出現指壓痕或輕輕撕扯肝包膜見肝組織呈絮狀判定。灌注時間過長會損傷細胞活力。

 

　　5.肝組織采集與初分散：停止灌注，小心摘取肝臟，放入含預冷終止液（含血清或白蛋白的培養基）的培養皿中。去除膽囊、脂肪及結締組織，用鑷子輕輕撕開肝包膜，用終止液反復吹打或輕搖，使解離的肝細胞釋放到懸液中。

 

　　三、細胞純化與收集

 

　　1.過濾：將細胞懸液經100至200微米細胞過濾器過濾，去除未消化的組織塊和血管碎片。

 

　　2.洗滌與離心：濾液以50至100倍重力加速度離心2至5分鐘，棄上清。沉淀用預冷培養基重懸，重復洗滌1至2次，每次離心條件相同。

 

　　3.密度梯度純化（可選）：若需進一步去除死細胞和非實質細胞，可將沉淀重懸后小心鋪在密度梯度分離液（如Percoll）上層，以適當轉速離心10至15分鐘，收集界面處的活肝細胞層。

 

　　4.活力檢測與計數：取少量細胞懸液與臺盼藍染液混合，鏡下觀察，不著色者為活細胞。計數活細胞比例及總細胞數，活細胞比例達到85%以上為合格。

 

　　四、后續處理

 

　　純化后的原代肝細胞可接種于膠原包被的培養板中，置于二氧化碳培養箱培養，用于后續實驗。所有操作應在無菌條件下進行，從動物處死到細胞接種完成控制在30至45分鐘內，以最大限度保證細胞活性與功能。