研究者通過(guò)構(gòu)建無(wú)菌小鼠(GF)與無(wú)病原體小鼠（SPF）的Lgr5-GFP小鼠模型，發(fā)現(xiàn)15周GF小鼠結(jié)腸存在形態(tài)異常：隱窩變短、增殖細(xì)胞減少、杯狀細(xì)胞分布異常，但兩組Lgr5+腸道干細(xì)胞數(shù)量無(wú)顯著差異。菌群不影響全局甲基化，但在腸道干細(xì)胞中篩選出1463個(gè)差異甲基化區(qū)域（DMR）與821個(gè)關(guān)聯(lián)基因。干細(xì)胞與分化上皮細(xì)胞共有683個(gè)DMR，可隨分化穩(wěn)定遺傳；其中51%位于增強(qiáng)子區(qū)域（Fig1a-c）。

SPF小鼠中共有DMR以低甲基化為主，低甲基化基因富集免疫與宿主防御通路，高甲基化基因富集發(fā)育相關(guān)通路。SPF小鼠MHC-II、天然免疫與宿主防御基因的啟動(dòng)子近端增強(qiáng)子區(qū)域顯著低甲基化，且該修飾可穩(wěn)定傳遞至分化細(xì)胞（Fig.1d-f）。SPF 組腸道干細(xì)胞與分化上皮中 MHC-II 及防御基因表達(dá)顯著升高，與 DNA 甲基化水平呈負(fù)相關(guān)（Fig. 1g）。

斷奶期（3周）SPF與GF小鼠的ISC和IEC均呈高甲基化，無(wú)顯著差異；成年SPF小鼠兩類細(xì)胞出現(xiàn)顯著低甲基化，GF小鼠無(wú)變化。對(duì)SPF小鼠不同年齡段檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MHC-II在4-6周快速去甲基化，宿主防御基因去甲基化更晚更慢；甲基化變化早于或同步于轉(zhuǎn)錄變化（Fig.2a-c）。

研究者設(shè)計(jì)了不同年齡腸道菌群移植（GMT）實(shí)驗(yàn)，宏基因組測(cè)序顯示各組移植后門水平定植效率相當(dāng)。斷奶后3-4周進(jìn)行GMT，能較有效恢復(fù)ISC中MHC?II的表觀調(diào)控；青春期或成年移植效果遞減，且無(wú)法充分恢復(fù)，證實(shí)斷奶后是關(guān)鍵窗口期（Fig.2d-f）。

研究者提出假說(shuō)：斷奶期菌群誘導(dǎo)的短暫IFNγ峰介導(dǎo)MHC-II調(diào)控區(qū)域的位點(diǎn)特異性去甲基化，他們發(fā)現(xiàn)僅在斷奶后阻斷IFNγ，會(huì)全面消除上皮MHC-II表達(dá)、破壞低甲基化與轉(zhuǎn)錄激活，而成年阻斷IFNγ無(wú)此效果（Fig.3a-c）。

圖3 斷奶后IFNγ信號(hào)是菌群誘導(dǎo)腸上皮MHC-II表觀遺傳調(diào)控的必需條件。斷奶后小鼠實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。剛斷奶的小鼠（3周齡）在2周內(nèi)接受對(duì)照IgG或IFNγ中和抗體處理共4次，3周后進(jìn)行檢測(cè)分析。結(jié)腸腸上皮細(xì)胞（IEC）的MHC-II表達(dá)流式結(jié)果顯示，阻斷IFNγ會(huì)消除上皮MHC-II的表達(dá); b. 對(duì)15周齡成年小鼠采用相同的處理方案、給藥頻率與檢測(cè)時(shí)間線。與斷奶后組不同，成年小鼠中和IFNγ并未顯著改變上皮MHC-II表達(dá);c. 分別檢測(cè)斷奶后組（藍(lán)色高亮）與成年組（黃色高亮）在使用/不使用抗IFNγ抗體處理時(shí)，MHC-II基因的DNA甲基化水平與基因表達(dá)量。僅在斷奶后短期內(nèi)阻斷IFNγ，會(huì)破壞菌群誘導(dǎo)的MHC-II基因低甲基化與轉(zhuǎn)錄激活；在成年期阻斷則無(wú)此作用。

4.革蘭氏陽(yáng)性菌介導(dǎo)表觀遺傳重編程

革蘭氏陽(yáng)性菌是強(qiáng)效IFNγ誘導(dǎo)物，因此研究者探究了其在生命早期對(duì)腸上皮MHC-II表觀遺傳編程的作用。用低劑量青霉素（LDP）持續(xù)處理孕鼠及其子代，以減少食糞小鼠體內(nèi)微生物（Fig. 4a）。小鼠腸道菌群在2-4周齡快速擴(kuò)張，斷奶后4-12周趨于穩(wěn)定（Fig. 4b）。LDP特異性降低革蘭氏陽(yáng)性菌，不影響整體菌群豐富度與擴(kuò)張能力；厚壁菌門、放線菌門豐度下降，擬桿菌門等革蘭氏陰性菌相對(duì)增加（Fig. 4b， c）。革蘭氏陽(yáng)性菌減少，導(dǎo)致腸道上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞（IEL）中CD4+IFNγ+ T細(xì)胞數(shù)量相應(yīng)下降（Fig. 4d）。LDP使結(jié)腸上皮MHC-II基因甲基化升高、表達(dá)降低；流式證實(shí)EpCAM+腸上皮細(xì)胞表面MHC-II蛋白表達(dá)下降（Fig. 4e， f）。早期LDP暴露使DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎發(fā)病更快、癥狀更重，表現(xiàn)為體重快速下降、疾病活動(dòng)指數(shù)升高、上皮持續(xù)損傷，對(duì)照組可明顯恢復(fù)（Fig. 4g-i）。生命早期菌群-IFNγ軸通過(guò)表觀遺傳調(diào)控腸上皮MHC-II，為斷奶后腸道干細(xì)胞（ISC）提供抵抗腸道炎癥與腫瘤發(fā)生的保護(hù)作用。

圖4 生命早期暴露于低劑量青霉素破壞斷奶后MHC-II信號(hào)通路的表觀遺傳調(diào)控。a. LDP處理及后續(xù)分析的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì); b. 對(duì)照組小鼠與LDP處理組小鼠在斷奶前（2周齡）及斷奶后（4-12周齡）糞便樣本的物種豐富度稀釋曲線。每條線代表一個(gè)糞便全基因組測(cè)序（WGS）樣本，顏色代表年齡組;c. 對(duì)照組與LDP處理組小鼠在斷奶前及斷奶后的微生物門水平相對(duì)豐度; d. LDP處理使8周齡小鼠中產(chǎn)生IFNγ的CD4+ T細(xì)胞減少; e. LDP處理改變了8周齡SPF小鼠腸上皮細(xì)胞（IEC）在斷奶后正常發(fā)生的MHC-II基因表觀重編程; f. LDP處理降低了8周齡小鼠上皮細(xì)胞MHC-II的表達(dá); g. 反復(fù)使用DSS進(jìn)行誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì); h， i. LDP預(yù)處理組與對(duì)照組小鼠在反復(fù)DSS誘導(dǎo)周期中的體重變化率（h）與疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）（i）。

5.菌群源性代謝物參與斷奶驅(qū)動(dòng)的表觀遺傳重編程

低劑量青霉素（LDP）會(huì)減少多種與斷奶過(guò)程相關(guān)的細(xì)菌屬，包括芽孢桿菌屬、糞桿菌屬、布勞特氏菌屬、羅斯氏菌屬、別樣桿菌屬、圖里西單胞菌屬/圖里西桿菌屬以及糞球菌屬（fig5a）。在菌種水平上，LDP會(huì)阻止鏈狀芽孢桿菌、韋氏芽孢桿菌、腸道羅斯氏菌、哈氏別樣桿菌的增殖，而這些細(xì)菌在斷奶后、固體食物中膳食纖維引入的情況下通常會(huì)大量增殖（fig5b）。LDP還會(huì)降低鼠李糖乳桿菌和生孢梭菌的豐度，這兩類菌可促進(jìn)微生物利用氨基酸合成α-酮戊二酸（α-KG），而α-KG是宿主DNA去甲基化酶發(fā)揮去甲基化作用的關(guān)鍵輔因子（fig5c）。GO分析顯示，表觀遺傳調(diào)控通路發(fā)生顯著改變（fig5d），包括影響α-KG生成的異檸檬酸脫氫酶活性、Fe2+跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性，以及抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）的甲硫氨酸γ-裂解酶活性（圖5e）。

綜上，斷奶過(guò)程所誘導(dǎo)的、可產(chǎn)生短鏈脂肪酸與α-酮戊二酸的微生物，共同參與了IFNγ介導(dǎo)的腸道干細(xì)胞MHC-II表觀遺傳重編程；而斷奶后使用LDP處理，會(huì)嚴(yán)重破壞這一腸道生理過(guò)程。

1.理論創(chuàng)新前景：揭示了生命早期菌群介導(dǎo)的表觀遺傳調(diào)控新層次，不改變?nèi)旨谆瑑H特異性作用于增強(qiáng)子區(qū)域，突破傳統(tǒng)以啟動(dòng)子為中心的甲基化調(diào)控范式。

2.機(jī)制研究前景：明確斷奶期是菌群調(diào)控腸道干細(xì)胞表觀編程的關(guān)鍵時(shí)間窗口，為后續(xù)探索腸道發(fā)育、免疫馴化的時(shí)序調(diào)控提供明確研究靶點(diǎn)，為菌群、代謝物、表觀修飾等交互作用研究提供可延伸的實(shí)驗(yàn)范式。

3.臨床轉(zhuǎn)化前景：上皮MHC-II表觀調(diào)控狀態(tài)可作為IBD、早發(fā)性結(jié)直腸癌的潛在生物標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)高危人群早期篩查。

4.未來(lái)研究方向：進(jìn)一步鑒定驅(qū)動(dòng)表觀重編程的關(guān)鍵功能菌株與代謝物，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)菌群干預(yù)。探索人類斷奶期是否存在保守的表觀調(diào)控關(guān)鍵窗口，完成小鼠到人類的轉(zhuǎn)化驗(yàn)證。研究表觀記憶的跨代傳遞可能性，拓展生命早期編程對(duì)長(zhǎng)期健康的影響邊界。