做過懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的人都清楚，搖床擺在哪里、跟誰做鄰居，直接影響著日常操作的順手程度。而比布局更重要的，是如何在長達(dá)數(shù)天的培養(yǎng)周期中保持細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定。本文記錄一次CHO-S細(xì)胞從復(fù)蘇到搖瓶擴(kuò)增的完整實(shí)驗(yàn)過程，穿插分享我們的設(shè)備布局思路和日常操作規(guī)范。

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)與材料

本次實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)是為3L小型生物反應(yīng)器準(zhǔn)備種子細(xì)胞，要求接種前細(xì)胞總量達(dá)到5×10?以上，活率不低于90%。采用的細(xì)胞系為CHO-S懸浮細(xì)胞，已在無血清培養(yǎng)基中適應(yīng)3代以上。

主要材料：CD CHO培養(yǎng)基、GlutaMAX補(bǔ)料、抗結(jié)團(tuán)劑、125mL和250mL透氣搖瓶、T75培養(yǎng)瓶、凍存管、計數(shù)板。

2、房間布局與設(shè)備定位

實(shí)驗(yàn)室面積約18㎡，布局思路是“以安全柜為中心，搖床和培養(yǎng)箱為雙翼，冰箱環(huán)伺外圍"。

具體位置：生物安全柜背靠內(nèi)墻，正面朝向房間中央，操作者站立區(qū)前方留出1.2m開闊空間。恒溫?fù)u床位于安全柜右側(cè)，兩者邊緣間距僅30cm，操作者從安全柜取出搖瓶后向右轉(zhuǎn)身即可放入搖床。CO?培養(yǎng)箱緊鄰搖床右側(cè)擺放，三臺設(shè)備形成一條連續(xù)的工作面。低溫冰箱（4℃和-80℃）并排放在安全柜左后側(cè)約3m處，冰箱前方設(shè)置一個中轉(zhuǎn)臺，用于臨時放置從冰箱取出的試劑瓶，待溫度平衡后再轉(zhuǎn)入安全柜。

3、復(fù)蘇與初始培養(yǎng)（操作詳錄）

步驟一：培養(yǎng)基與試劑預(yù)處理

提前一晚將CD CHO培養(yǎng)基從4℃冰箱移至室溫環(huán)境（約22~25℃）過夜平衡。補(bǔ)料液分裝至50mL離心管備用。啟動CO?培養(yǎng)箱和恒溫?fù)u床進(jìn)行預(yù)熱，培養(yǎng)箱設(shè)定37℃、5% CO?、濕度≥95%；搖床設(shè)定37℃、120rpm、5% CO?。至少預(yù)熱2小時以上，待設(shè)備溫場穩(wěn)定后再開始操作。

步驟二：細(xì)胞復(fù)蘇

取一支凍存管（1.5mL，含1×10?細(xì)胞），迅速于37℃水浴解凍。水浴時手持凍存管不停畫圈搖動，觀察到冰晶即將消失時（約1分20秒）立刻取出，用酒精棉擦拭外壁后置入安全柜。

在安全柜內(nèi)，用寬口移液管將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到含9mL預(yù)溫培養(yǎng)基的離心管中。操作要點(diǎn)：移液管貼近液面，緩慢滴加，同時輕輕晃動離心管，讓細(xì)胞均勻分散。

200×g離心5分鐘后棄上清。用2mL培養(yǎng)基重懸沉淀，轉(zhuǎn)移至T75培養(yǎng)瓶（已預(yù)先加15mL培養(yǎng)基），最終體積17mL。標(biāo)記后放入CO?培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

步驟三：觀察與傳代

培養(yǎng)48小時后取出T75瓶，倒置顯微鏡下觀察：CHO-S細(xì)胞呈明亮圓形，邊緣光滑，細(xì)胞間可見少量小團(tuán)簇但大部分為單細(xì)胞懸游狀態(tài)。活率經(jīng)臺盼藍(lán)染色計數(shù)為94%。

取1mL懸液計數(shù)，總細(xì)胞數(shù)約2.6×10?。按0.5×10?/mL的起始密度接種至125mL搖瓶（工作體積30mL），放回恒溫?fù)u床開始振蕩培養(yǎng)。

4、日常監(jiān)測與補(bǔ)料操作

從振蕩培養(yǎng)第1天起，每日定時取樣檢測并記錄數(shù)據(jù)。具體操作如下：

關(guān)閉搖床振蕩（使用搖床的暫停功能），打開艙門，取出搖瓶后立即關(guān)門。

安全柜內(nèi)取1mL樣品用于計數(shù)，同時觀察培養(yǎng)基顏色（酚紅指示劑）。亮黃色提示pH偏低可能酸度過高，紫紅色提示pH偏高可能存在污染或堿化。

計數(shù)結(jié)果記錄后，根據(jù)細(xì)胞密度決定補(bǔ)料策略：

補(bǔ)料操作的具體手法：用移液器吸取補(bǔ)料液后，將移液器伸入搖瓶瓶口內(nèi)壁上方約1cm處緩慢注入，避免液體直接沖擊液面造成細(xì)胞剪切損傷。補(bǔ)加完畢后，輕搖搖瓶數(shù)秒使培養(yǎng)基混勻，擰緊瓶蓋放回?fù)u床。

5、放大培養(yǎng)與最終收獲

第4天細(xì)胞密度達(dá)到6.8×10?/mL，活率90%，滿足放大條件。取新的250mL搖瓶，加入45mL新鮮培養(yǎng)基，計算所需細(xì)胞量為4×10?個（對應(yīng)原搖瓶中約6mL懸液），接種后補(bǔ)加培養(yǎng)基至總工作體積80mL，起始密度0.5×10?/mL。放回?fù)u床繼續(xù)培養(yǎng)3天后，總細(xì)胞量達(dá)到約4×10?，可用于反應(yīng)器接種。

6、布局對操作的實(shí)際影響

通過這段時間的實(shí)驗(yàn)操作，我們切身感受到設(shè)備布局對效率的直接影響。生物安全柜與搖床距離近，取樣時從取出搖瓶到進(jìn)入安全柜開蓋操作，時間不超過10秒，避免了細(xì)胞懸液在非潔凈環(huán)境中長時間暴露。培養(yǎng)箱與搖床并排放置，從靜置培養(yǎng)到振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)換只需單手傳遞培養(yǎng)瓶，操作流暢。

而冰箱如果放在安全柜正對面，每次開門取試劑時，冷氣流會直吹安全柜正面，干擾操作區(qū)域的下沉氣流。所以我們把冰箱移到側(cè)后方位置，避開安全柜的正面氣流區(qū)，這個細(xì)節(jié)對維持無菌環(huán)境很重要。

7、常見異常及處理

本次實(shí)驗(yàn)中遇到的一個小狀況：第3天發(fā)現(xiàn)搖床實(shí)際溫度顯示37.2℃，比設(shè)定值偏高0.2℃，但仍在可接受范圍。檢查后發(fā)現(xiàn)是搖床放置在距離墻壁太近的位置（原只有8cm），散熱不良導(dǎo)致。后將搖床向前移出至離墻25cm，溫度恢復(fù)穩(wěn)定。建議搖床背后至少預(yù)留20cm散熱間距。

另一個值得注意的細(xì)節(jié)：搖瓶在搖床內(nèi)如果擺放不對稱（如僅放一瓶且未配平），會導(dǎo)致?lián)u床在高速運(yùn)轉(zhuǎn)時產(chǎn)生明顯晃動，長期運(yùn)行可能損壞偏心輪機(jī)構(gòu)。建議用空搖瓶裝等量純水放在對稱位置進(jìn)行配平，或一次性放置偶數(shù)個搖瓶。

結(jié)語

恒溫?fù)u床、CO?培養(yǎng)箱、生物安全柜和低溫冰箱，這四臺設(shè)備在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中的配合關(guān)系，就像一張桌子的四條腿——缺一條都不穩(wěn)，但擺得不好也容易互相絆腳。以操作者為中心，按“取-做-培-存"的單向流線來布局，是我們在反復(fù)調(diào)整后驗(yàn)證的方案。

上海赫田科學(xué)儀器有限公司致力于提供高品質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室溫控振蕩設(shè)備，目前產(chǎn)品系列包括：恒溫?fù)u床（恒溫振蕩器）、疊加式恒溫?fù)u床（支持兩層或三層獨(dú)立控溫疊加）、大容量立式恒溫?fù)u床（適合大體積培養(yǎng)或微生物發(fā)酵）、光照恒溫?fù)u床（適用于藻類及植物細(xì)胞培養(yǎng)）、低溫?fù)u床（帶制冷，4℃起控）、脫色搖床（主要用于蛋白電泳凝膠染色脫色）、水浴恒溫振蕩器（適用于酶解、組織勻漿等需要水浴溫控的場景）以及振蕩培養(yǎng)箱。無論您的實(shí)驗(yàn)對象是細(xì)菌、酵母、藻類還是哺乳動物細(xì)胞，赫田均有針對性設(shè)計的機(jī)型可供匹配。好實(shí)驗(yàn)離不開好設(shè)備，選擇赫田，讓您的細(xì)胞培養(yǎng)事半功倍。