脂質是生物體重要的結構基石和功能分子。以甘油磷脂、膽固醇為核心的脂質分子組成細胞膜雙分子層結構，為生命活動提供穩定的物理屏障和微環境；而甘油三酯直接參與能量動員和新陳代謝，神經酰胺、類花生酸和磷脂酰肌醇是重要的信號轉導介質。因此，全面表征脂質結構有助于揭示脂質與其他生物分子復雜的功能網絡。

脂質的精細結構表征通常包含如下多個層級的結構信息[1,2]：1) 確定脂質種類（主要通過識別脂質的頭基）；2）確定脂質亞類（通過識別脂肪酸連接方式確認屬于醚脂、縮醛磷脂或酰基脂等）；3）脂質分子的總體脂肪酸水平；4）脂質分子各酰基脂肪酸水平；5）不飽和脂肪鏈碳碳雙鍵（C=C）位置和立體構型、其他修飾（如甲基、環丙基、羥基等）位置；6）脂肪酸鏈sn位置（圖1）。其中，高分辨質譜和串聯質譜已經實現前四個水平的脂質結構鑒定，但對于表征脂質C=C和sn位置仍存在巨大挑戰。

圖1. 脂質分子的鑒定水平（點擊查看大圖）

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Thermo Scientific™ Orbitrap™ Tribrid™ 三合一質譜全面解析脂質結構

以磷脂酰膽堿（PC）為例，傳統LC-MS分析中PC在正離子模式下只能得到頭基離子（m/z 184.07）的碎片（圖2上），并不能得到脂肪酸鏈的組成信息，因此通常需要結合負離子模式確定酰基組成。在Orbitrap™ Tribrid™ 三合一系列質譜中, 除了應用常規beam-type HCD碎裂得到頭基信息外，還可以利用阱內CID（ion-trap CID）直接在一針正模式分析中獲得完整脂肪酸組成信息，極大提高脂質組學的分析通量（圖2下）。

圖2.PC(16:0/18:1)的HCD（上）和CID（下）正模式MS/MS譜圖。在HCD模式下，只能觀測到頭基離子信號；而在CID譜圖中，可以觀測到FA(16:0)和FA(18:1)中性丟失離子，從而獲得PC(16:0/18:1)分子組成。

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再如甘油三酯（TG）的結構解析中，二級質譜只能在中性丟失水平上推測TG三條脂肪酸鏈可能的組成信息， 但針對共流出的異構體物種缺乏分辨能力。例如雖然TG(48:1) MS2譜圖可以通過FA(18:1), FA(16:0) 和FA (14:0) 三條酰基鏈中性丟失推斷該TG為TG(14:0/16:0/18:1)。但利用Orbitrap三合一質譜的多級質譜分析功能，可以在MS3譜圖層面輕松分辨出其中共流出的TG(16:1/16:0/16:0) 分子種，極大提高TG分子的鑒定深度（圖3）。

圖3.TG(48:1)分子的結構表征。MS2需要通過三條脂肪鏈中性丟失離子的排列組合推斷其分子組成，但對于共流出的異構體無分辨能力。而通過MS3分析可以進一步得到脂肪酸鏈診斷離子，特別是對共流出TG的鑒定具有重要作用（點擊查看大圖）

基于此，針對復雜脂質組學分析，我們在Orbitrap™ IQ-X™ Tribrid™ 三合一質譜中搭建了如圖4所示的質譜分析模板用于非靶向脂質組學分析。首先對傳統HCD-MS2譜圖快速掃描，針對PC頭基離子觸發CID-MS2補充其脂肪鏈組成信息；針對TG的特定中性丟失觸發HCD-MS3提供更精準的結構注釋。

圖4.完整脂質組學分析質譜模板

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UVPD精確表征甘油磷脂C=C位置

脂質的雙鍵結構顯著影響生物膜通透性和內環境動態平衡，大量研究證實表征脂質C=C位置有助于了解細菌耐藥和腫瘤發生發展。脂質的C=C在200nm的波長范圍內存在一定的紫外吸收，因此193nm和213nm的紫外光解離（UVPD）技術在脂質結構深度表征方面起到了重要作用。Thermo Scientific™ Orbitrap™ Tribrid™ 三合一系列質譜（如IQ-X，Ascend等型號）可附加UVPD模塊用于脂質C=C位置的深度表征（圖5）。該模塊將213nm紫外光照射進入雙壓線性離子阱，被離子阱捕獲的脂質C=C雙鍵在吸收光子后發生π-π*躍遷進入激發態，誘導鄰位C-C鍵斷裂，形成一對相差24Da的診斷離子，從而指認C=C位置[2]（圖5）。

圖5. UVPD可作為附加模塊配置在Orbitrap™ IQ-X™等三合一系列質譜，UVPD工作原理以及分析C=C診斷離子

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以PC(16:0/18:1n-9)為例，在UVPD激發下C=C鄰位C-C斷裂，形成x+1炔離子和x-1烷基離子，這兩個診斷離子分子量相差24Da,可用于C=C雙鍵位置（x）的確認[4]。相比于其他碎裂方式，UVPD對C=C的碎裂更具有選擇性，診斷離子附近無其他干擾離子，即使需要放大譜圖查找，也極易識別（圖6）。在真實的鼠腦組織中，UVPD成功鑒定出PC（18:1/18:1）的三種C=C異構體，包括PC（18:1 n-9/18:1 n-9）、PC（18:1 n-7/18:1 n-7）、PC（18:0/18:2n-6,9）等（圖7）。

圖6. PC（16:0/18:1n-9）標準品和血漿樣本UVPD-MS2譜圖。UVPD激發可以誘導C=C鄰位斷裂，形成質量數相差24Da的雙鍵診斷離子（點擊查看大圖）

圖7. 真實小鼠腦組織樣本中PC（18:1/18:1）雙鍵異構體鑒定和表征（點擊查看大圖）

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UVPD 用于脂質sn位置的深度表征

磷脂的兩條脂肪鏈的sn位置反映了脂質從頭合成過程，但LC-MS通常難以分離sn異構體。磷脂酶A（PLA1和PLA2）選擇性水解法雖然可以成功鑒定sn異構體，但檢測通量較低。研究發現，磷脂酰膽堿的堿金屬加合離子在HCD/CID解離后會丟掉頭基離子，通過重排反應形成的二氧戊環結構，UVPD會特異性切斷sn-2位置脂肪酸鏈，得到僅含sn-1脂肪酸鏈的診斷離子，因此可以用于磷脂和TG的sn-異構體鑒定[5]。UVPD-MS3無需放大譜圖即可識別特征sn異構離子，可用于常規非靶向脂質組學分析工作流。

圖8. PC（16:0/18:1）sn結構鑒定，選擇堿金屬加合離子[M+Na]+產生的HCD/CID-MS2譜圖中[M+Na-183]+碎片離子，進一步觸發UVPD-MS3，可以得到選擇性sn-1脂肪鏈結構信息，從而推測PC的sn位置

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相關應用文獻

（1）

UVPD全面表征甘油磷脂結構

甘油磷脂(GPLs)是細胞膜主要成分之一，顯著影響細胞膜流動性和通透性，細菌通過調控甘油磷脂改變細胞膜表面電荷從而影響抗生素耐藥。其中，磷脂的環丙基修飾與結核分枝桿菌耐藥相關，但傳統的CID/HCD技術無法表征環丙基結構的位置。考慮到環丙烷基在200nm波長附近也存在紫外吸收，德克薩斯大學奧斯汀分校的研究小組利用UVPD技術輕松誘導環丙基鄰位C-C鍵斷裂產生間隔14Da的診斷離子對，從而實現環丙基磷脂的精確定位，并在大腸桿菌和結核分枝桿菌中鑒定出一系列未曾報道的甘油磷脂環丙基修飾結構（圖9上）。隨后，該小組應用HCD/UVPD對細菌GPLs進行了綜合、全面的結構解析，闡明了細菌脂質中不飽和鍵（碳碳雙鍵、環丙基）、羥基和烷基等修飾與細菌耐藥性的關系[5,6]（圖9下）。

圖9. 全面表征甘油磷脂結構，包括C=C位置、環丙基位置、羥基位置等，揭示甘油磷脂不飽和鍵種類和分布于細菌耐藥機制的關系（點擊查看大圖）

（2）

其他重要脂質分子精細結構解析

除了在正離子模式下表征GPLs外，UVPD也成功應用于表征包括羥基脂肪酸酯[7]、鞘脂[8]、固醇[9]、糖脂[10,11]等脂質結構。例如，心磷脂含有四條酰基鏈，是一種復雜程度更高的脂質，采用混合碰撞（CID×UVPD）方法可以精確定位心磷脂四個酰基鏈碳碳雙鍵和環丙基不飽和鍵的位置[12]，而通過化學衍生化結合HCD/UVPD可以進一步解析心磷脂的sn-異構體[13]，實現未知心磷脂結構的從頭注釋（圖10）。除此之外，UVPD也被證實可以在負離子模式下應用于游離脂肪酸和磷脂酰甘油（PG）等結構表征[14]。

圖10. CID/HCD與UVPD混合碎裂用于心磷脂C=C雙鍵和sn位置的確認（點擊查看大圖）

（3）

DESI-UVPD用于不飽和磷脂的空間成像

解吸電噴霧電離（DESI）常用于脂質分子的空間成像，但傳統MS1成像對同分異構體的識別能力顯然不足。研究者利用UVPD活化脂質產生的C=C診斷離子強度(Im/z 660+684)/(Im/z 688+712) 反映PC 16:0_18:1(n-9),和PC 16:0_18:1(n-7)]在腦組織切片中的分布，實現癌組織和癌旁組織區域的病理勾畫[15]。

圖11. DESI-UVPD-MS2用于脂質C=C異構體成像

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總   結

在生命科學研究中，脂質分子以其結構復雜性和動態多樣性承載細胞膜和物理屏障構建、信號傳遞和能量代謝的核心使命。Thermo Scientific™ Orbitrap™ Tribrid™ 三合一系列質譜重塑脂質結構鑒定的通量和深度，其通過多級質譜解析和多重碎裂技術（HCD,CID,UVPD）突破脂質分析的極限，實現在碳碳雙鍵、sn位置及酰基修飾模式等方面的深度洞察，從而終結脂質分子結構的模糊解析，更好地助力全球科學家在代謝脂質組學領域的科研突破。

參考文獻：

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