2025 年 4 月 4 日，美國加州斯克利普斯研究所的Kendall W. Nettles教授和John R. Yates III教授作為共同通訊作者在nature chemical biology雜志上發(fā)表了題為《Native top-down proteomics enables discovery in endocrine-resistant breast cancer》的文章，該文開發(fā)了一種Native top-down proteomics（nTDP） 策略，用于識別乳腺癌細胞（包括過表達表皮生長因子受體（EGFR）的內(nèi)分泌抵抗模型）中≤70 kDa 的蛋白質(zhì)組復合物，共鑒定出17 種蛋白質(zhì)復合物的 104 種 complexoforms（蛋白質(zhì)復合物的特定組裝形式）。該研究發(fā)現(xiàn)，EGFR 可誘導核轉運因子 2（NUTF2）組裝體解離，而 NUTF2 的 K4 和 K55 翻譯后修飾位點對雌激素受體（ER）信號通路的抑制有差異化影響。該研究揭示了乳腺癌蛋白質(zhì)組的分子特征及 complexoforms 在腫瘤生長和治療抵抗中的作用，為理解疾病機制和開發(fā)藥物提供了新視角。

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一

研究背景

世衛(wèi)組織國際癌癥研究機構最新發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2020年全球乳腺癌新發(fā)病例高達226萬例，超過了肺癌的220萬例。 乳腺癌已經(jīng)取代肺癌，成為全球第一大癌癥。蛋白質(zhì)通過非共價相互作用組裝形成功能復合物，驅動細胞內(nèi)包括乳腺癌等惡性腫瘤相關的幾乎所有關鍵功能，而蛋白質(zhì)因差異剪接、序列變異、翻譯后修飾（PTMs）或突變產(chǎn)生的多種 proteoform 會影響這些功能復合物的形成、穩(wěn)定性和活性。傳統(tǒng)的自下而上蛋白質(zhì)組學方法在闡明單個蛋白質(zhì)產(chǎn)生的 proteoform、表征與蛋白質(zhì)復合物結合的配體和輔因子以及繪制組合 PTMs 模式方面存在局限。原生質(zhì)譜（Native MS）和自上而下蛋白質(zhì)組學（Top-down Proteomics）結合形成的Native Top-down Proteomics（nTDP）雖有結構解析能力，但因復雜生物樣本中蛋白質(zhì)復合物豐度低，蛋白質(zhì)復合物分離困難，缺乏處理大規(guī)模 nTDP 數(shù)據(jù)集的生物信息學工具的等問題，nTDP目前主要用于純化的蛋白質(zhì)復合物的分析中，在復雜生物樣中的應用較少。在乳腺癌研究中，生長因子信號傳導是內(nèi)分泌治療抵抗的主要機制之一，表皮生長因子受體（EGFR）擴增及下游信號成分突變與臨床他莫昔芬抵抗相關，但具體機制尚未明確。因此，需要一種有效的方法來研究乳腺癌細胞中蛋白質(zhì)組裝體的特征，以深入理解疾病分子機制和設計有效藥物，這為該研究開發(fā)并應用 nTDP 策略提供了背景和動力。

二

研究方法

1

研究對象：

雌激素受體 α（ERα）陽性的 MCF-7 乳腺癌細胞（后續(xù)稱MCF-7細胞）和過表達表皮生長因子受體（EGFR）的 MCF-7 細胞（作為 ER 靶向治療的耐藥模型，后續(xù)稱MCF-7-EGFR細胞）。

2

nTDP 工作流程

研究者開發(fā)的nTDP 工作流程如圖1所示，首先利用離線native尺寸排阻色譜（nSEC）將從細胞中提取可溶性蛋白質(zhì)復合物進行分離；隨后通過nano-ESI–FAIMS–MSn（液相：Easy-nLC 1200，氣相分離裝置：FAIMS，質(zhì)譜：Orbitrap Fusion Lumos ）對蛋白復合物進行native top-down的表征分析；最后利用ProSight Native軟件結合手動校正解析復雜質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

圖1：nTDP 工作流程（點擊查看大圖）

三

研究結果

1

nTDP 工作流程驗證

研究者首先利用三個蛋白復合物：carbonic anhydrase II(CA II，~29.1 kDa)，streptavidin (SA， ~53 kDa) ，avidin (AV，~67 kDa)來驗證該 nano-ESI–FAIMS–MSn 系統(tǒng)的重現(xiàn)性和穩(wěn)健性。結果表明該系統(tǒng)可以穩(wěn)定的分離、碎裂蛋白復合物，產(chǎn)生能有效闡明蛋白質(zhì)表征的質(zhì)譜數(shù)據(jù)（圖2-4）。同時還驗證了FAIMS可以在氣相水平上對高到70kDa蛋白復合物進行分離。（圖5）

圖2：CA II 的 nTDP 譜圖及其由 ProSight Lite 生成的碎片圖（點擊查看大圖）

圖3：SA 的 nTDP 譜圖及其由 ProSight Lite 生成的碎片圖（點擊查看大圖）

圖4：AV的 nTDP 譜圖及其由 ProSight Lite 生成的碎片圖（點擊查看大圖）

圖5：標準蛋白質(zhì)復合物的基峰遷移圖及其CV值

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2

nTDP 分析MCF-7 和 

MCF-7–EGFR 細胞提取物

隨后研究者用nSEC系統(tǒng)對乳腺癌細胞（MCF-7和MCF-7-EGFR）的細胞提取物進行分離，nSEC譜結果表明從MCF-7 和 MCF-7–EGFR （16次重復實驗）提取的蛋白復合物均能穩(wěn)定有效的分離。將分離的蛋白復合物用nano-ESI–FAIMS–MSn 系統(tǒng)進行檢測，共測出17 種蛋白質(zhì)復合物的104 種 complexoforms，包括蛋白質(zhì) - 金屬復合物、蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì) - 金屬復合物及蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)復合物。

圖6：MCF-7中的蛋白質(zhì)標品和蛋白質(zhì)聚集體的nSEC譜圖、MCF-7細胞中蛋白質(zhì)聚集體膠圖、MCF-7-EGFR中的蛋白質(zhì)標品和蛋白質(zhì)聚集體的nSEC譜圖、MCF-7-EGFR細胞中蛋白質(zhì)聚集體膠圖。（點擊查看大圖）

3

與乳腺癌相關的蛋白質(zhì)復合物表征分析

• TPI  complexoforms：TPI是一種與乳腺癌相關的糖酵解酶，有研究表明TPI可能與藥物耐藥、腫瘤進展和轉移有關。研究者在MCF-7和MCF-7–EGFR細胞中均觀察到TPI二聚體結構，分子質(zhì)量約為53 kDa（nSEC-fraction4）。二聚體 TPI 復合物是由截短和磷酸化的單體蛋白質(zhì)變體組合形成，單體蛋白質(zhì)變體上發(fā)生兩個脫酰胺（N15 和 N71）。研究者還發(fā)現(xiàn)了由突變（E104D）TPI單體形成的TPI復合物，并且E104D單體亞基的TPI可以被磷酸化、去酰胺化或乙酰化。

圖7： MCF-7細胞提取物中TPI complexoforms復合物的nTDP譜圖（點擊查看大圖）

• MIF complexoforms：MIF是在多種癌癥、自身免疫疾病和炎癥中具有生物學相關性的多功能細胞因子，研究者發(fā)現(xiàn)MIF在 MCF-7 和 MCF-7-EGFR 細胞中均高表達，native MS1 譜圖提供了MIF complexoforms的詳細信息，一共形成了五種 MIF（同源和異源）三聚體結構。通過MSn的譜圖解析發(fā)現(xiàn)了截短的、未修飾的、亞硝基化和乙酰化的MIF單體蛋白質(zhì)變體（亞硝基化和乙酰化分別發(fā)生在C80和K77上）。

圖8： MCF-7細胞提取物中MIF complexoforms復合物的nTDP譜圖（點擊查看大圖）

• SOD1 complexoforms：金屬酶SOD1是一種重要的抗氧化劑，對于癌基因驅動的乳腺腫瘤形成以及超氧化物轉化為O2和H2O2至關重要。研究者在 MCF-7 和 MCF-7-EGFR 細胞中觀察到分子質(zhì)量約為 32 kDa 的 SOD1 二聚體結構，從MS1譜圖（11 + 電荷狀態(tài)）和MS2譜圖（6 + 電荷狀態(tài)）中均觀察到SOD1蛋白質(zhì)變體亞基中Cu2+ 和 Zn2+金屬離子的非共價結合，SOD1 蛋白質(zhì)變體還帶有 N 端乙酰化、一對二硫鍵（C57-C111）和N-端甲硫氨酸的切除。

圖9： MCF-7細胞提取物中SOD1 complexoforms復合物的nTDP譜圖（點擊查看大圖）

• NUTF2 complexoforms：NUTF2是一種二聚體蛋白，介導小GTP酶Ran的核內(nèi)轉運。研究者從 MCF-7 和 MCF-7-EGFR 細胞中共鑒定出8 種不同 PTM 組合的NUTF2 蛋白質(zhì)變體，且這些單體在26 種不同的complexoforms中分布。從MS1譜圖中發(fā)現(xiàn)，與 MCF-7 細胞相比，MCF-7-EGFR 中內(nèi)源性 NUTF2 二聚體復合物含量顯著減少，且具有三個乙酰化的 NUTF2 異二聚體是 MCF-7-EGFR 細胞特有的。

圖10： MCF-7和MCF-7–EGFR細胞提取物中NUTF2的nTDP譜圖（點擊查看大圖）

圖11：MCF-7和MCF-7–EGFR細胞提取物中NUTF2 complexoforms 和proteoforms 的強度信息（點擊查看大圖）

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4

NUTF2介導EGFR和ER通路之間的相互作用

前期nTDP數(shù)據(jù)結果發(fā)現(xiàn)MCF-7-EGFR細胞中NUTF2 二聚體的數(shù)量顯著比MCF-7細胞中低，研究者利用NUTF2 與兩種不同的親和標簽共同沉淀，驗證 了EGFR 可誘導核轉運因子 2（NUTF2）二聚體解離這一結論。NUTF2 的翻譯后修飾（PTM）位點在脊椎動物中具有保守性，NUTF2蛋白復合物的晶體結構表明，K4靠近核孔蛋白結合位點。K55和K63靠近Ran結合位點，其中K55參與Ran與NUTF2之間的水介導接觸，因此研究者對K4和K55位點進行了突變。結果表明，MCF-7細胞中NUTF2 的表達抑制乳腺癌細胞生長， K4Q 突變可逆轉該抑制，K55R 突變則增強抑制，這表明 PTM 位點（K4、K55）可通過影響核孔結合或 Ran 相互作用調(diào)節(jié)細胞生長。NUTF2下調(diào)了雌激素誘導的增殖基因GREB1，而K4Q突變可在沒有4OHT的情況下恢復了這一表型。這表明不同 PTM 位點的 NUTF2 proteoforms 會導致不同的生物學結果。

圖12 ：NUTF2 調(diào)節(jié)ER的信號傳導并抑制生長

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為了進一步研究 NUTF2 如何調(diào)節(jié) ER 信號傳導和對 4OHT 的響應，通過 CUT&RUN 技術分析發(fā)現(xiàn)，MCF-7 細胞中 ER 與 NUTF2 的結合位點基本不重疊，但 NUTF2 表達和 4OHT 處理會改變 ER 的結合模式。NUTF2 表達會導致 ER 在 1353 個位點的結合存在差異，且 4OHT 處理后 MCF-7 與 MCF-7NUTF2 細胞的 ER 結合位點既有重疊也有差異。但在 4OHT 敏感的 NUTF2 位點僅發(fā)現(xiàn) 132 個共有 ER 基序半位點（即 '1-AGGTCA'），這表明 NUTF2 通過間接機制調(diào)節(jié) ER 染色質(zhì)占有率和活性。為了更清楚的了解NUTF2 生長抑制的分子機制，研究者完成了 MCF-7 和 MCF-7NUTF2 細胞的 RNA-seq，基因集富集分析表明在 600 多個差異表達基因中，包括上調(diào) RNA 分解代謝相關基因、NuRD 復合物成分（如 HDAC1）和凋亡基因 ERRFI1、下調(diào)線粒體氧化磷酸化相關基因（如 BCL2）和致癌基因（如 RAS 家族基因）。通路富集分析表明，這些基因涉及多種癌癥和 EGFR 相關通路，支持 NUTF2 作為 EGFR 信號效應因子的作用。ERα-APEX2 鄰近蛋白質(zhì)組學研究顯示，NUTF2 表達會改變 ER 的相互作用組，包括 JunB 標記增加、腫瘤抑制因子 HSPBP1 和 CSDE1 標記減少等。對比 NUTF2:WT 與 NUTF2:K4Q 細胞，發(fā)現(xiàn) ER 相互作用組存在差異（如 CNOT9 標記增加、DNMT3A 標記減少），進一步證實 NUTF2 通過調(diào)控 ER 相關蛋白相互作用影響通路。

圖13：NUTF2-ER的相互作用

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四

結論與意義

1

nTDP 方法學的成功建立與應用

該研究優(yōu)化 nTDP workflow，結合離線原生尺寸排阻色譜（nSEC）、納米電噴霧電離（nano-ESI）、場不對稱離子遷移譜（FAIMS）和多級串聯(lián)質(zhì)譜（MSn），成功從乳腺癌細胞（MCF-7 及MCF-7 -EGFR ）中鑒定出 17 種蛋白質(zhì)復合物的 104種 complexoforms，包括 蛋白- 金屬復合物、蛋白-蛋白- 金屬復合物、蛋白-蛋白復合物等，且能表征≤70 kDa 的內(nèi)源性蛋白質(zhì)組裝體，克服了傳統(tǒng)方法在復雜生物樣本中分析低豐度蛋白質(zhì)復合物的局限。

2

關鍵蛋白質(zhì)復合物的發(fā)現(xiàn)與功能解析

識別了與癌癥相關的關鍵蛋白質(zhì)復合物，如磷酸丙糖異構酶（TPI）、巨噬細胞遷移抑制因子（MIF）、超氧化物歧化酶（SOD1）的 complexoforms，明確了其翻譯后修飾（PTMs）位點（如 TPI 的脫酰胺、磷酸化，MIF 的亞硝基化、乙酰化，SOD1 的金屬結合位點等）及其對復合物結構和功能的影響。核心發(fā)現(xiàn)：EGFR 過表達會誘導核轉運因子 2（NUTF2）二聚體解離。NUTF2 二聚體作為核孔穿梭蛋白參與 RAN 的核輸入，其過表達可抑制乳腺癌細胞生長，而不同 PTM 位點（K4 和 K55）的突變會逆轉或加劇這一抑制效應，表明 NUTF2 的 PTMs 通過調(diào)節(jié)雌激素受體（ER）信號通路影響乳腺癌生長。

3

NUTF2 與乳腺癌內(nèi)分泌抵抗的關聯(lián)機制

NUTF2 通過間接調(diào)節(jié) ER 的 DNA 結合和蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡影響 ER 信號通路，例如下調(diào)雌激素誘導的增殖基因 GREB1，上調(diào)凋亡基因 ERRFI1 等，從而抑制乳腺癌細胞生長。EGFR 過表達（內(nèi)分泌治療抵抗模型）會減少 NUTF2 二聚體水平，改變其 PTMs 模式，導致 NUTF2 對 ER 信號的調(diào)控作用異常，可能是 EGFR 介導的他莫昔芬抵抗的重要機制之一。

4

nTDP 的領域意義

該方法為復雜生物樣本中內(nèi)源性蛋白質(zhì)復合物的大規(guī)模分析提供了新范式，能夠保留脆弱的非共價相互作用，精準表征 proteoform 的 PTMs、組裝模式及配體結合，為癌癥生物學、藥物靶點發(fā)現(xiàn)和結構生物學研究開辟了新途徑，尤其為理解乳腺癌治療抵抗的分子機制提供了關鍵見解。

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