通過ALPHA surefire ultra技術進行定量的細胞水平磷酸化檢測

閱讀：720 發布時間：2020-4-29

小膠質細胞是髓系細胞，在介導中樞神經系統 (CNS) 中的炎性反應方面起重要作用。在其他任務中，小膠質細胞負責識別和消除外來入侵者，并修復由損傷引起的局部 CNS 組織損害。小膠質細胞受體-接頭蛋白復合體 [稱為骨髓細胞 2 表達的觸發受體 (TREM2) 和 12 kDa DNAX 激活蛋白 (DAP12)] 的功能經證實在 AD 和帕金森病等多種神經退行性疾病中非常重要。TREM2 和 DAP12 之間的相互作用很可能介導與吞噬和碎片清除、促炎性細胞因子產生和釋放的調節，以及促進小膠質細胞增殖和存活的轉錄變化有關的多種神經炎性反應。因此，TREM2/DAP12 功能變化直接影響小膠質細胞激活的時間和程度，從而影響神經元功能和存活。

TREM2 是一種跨膜糖蛋白，由胞外免疫球蛋白樣結構域、跨膜結構域和胞質部分，其中胞質部分與 DAP12 結合，起到信號轉導功能。TREM2 有來自病原體的外源配體，還有暫時尚未明確的內源配體。胞外配體結合會激活 TREM2，這反過來會激活 DAP12，從而導致胞內信號轉導事件發生級聯反應。具體而言，DAP12 包含一個基于免疫受體酪氨酸的激活基序 (ITAM)，其中酪氨酸殘基在 TREM2 結合配體時會被磷酸化。然后這會募集 Syk 激酶來激活下游信號轉導分子。

本文采用了 TREM2-/- 的小鼠對 TREM2 在脂質代謝以及 TREM2 缺失引起的小膠質細胞的膽固醇堆積的來源進行了探討。發現TREM2在小膠質細胞脂質代謝過程中的重要作用以及myelin是膽固醇堆積的重要來源。TREM2 正常表達的動物和細胞在 TREM2 收到激活后，可以引起 DAP12 的自磷酸化，進一步招募 SYK 蛋白并將其磷酸化，激活 SYK 信號通路，激活下游的 DAM 和脂類代謝的基因，從而將小膠紙細胞吞噬的 myelin 膽固醇正常代謝為自由化的膽固醇。本文前期的大量的細胞實驗和動物實驗都驗證了 TREM2 的功能，同時也構建了SYK的磷酸化檢測平臺，通過 ALPHA surefire ultra 的技術對 SYK 的磷酸化水平進行定量分析。

ALPHA surefire ultra技術是珀金埃爾默公司基于ALPHA平臺開發出的細胞磷酸化檢測工具。新的 AlphaLISA Surefire Ultra 采用成熟的 CaptSureTM 技術代替 Protein A，不僅實現了試劑盒抗體捕獲的特異性，而且具有更低的檢測背景。新的試劑盒利用 AlphaLISA 受體微珠代替 AlphaScreen 受體微珠，對血紅蛋白淬滅干擾具有更加出色的光譜特性。ALPHA 檢測本身非常簡單。

ALPHA surefire Ultra 平臺的特點：

步驟簡單，減少時間和人工

細胞樣本經過刺激、裂解后，只需要將試劑組分加入裂解液，無需任何多余的洗滌步驟。

高靈敏度及定量化檢測

檢測靈敏度大于等于 Western Blot 方法；可以檢測過表達蛋白靶點及內源水平表達的蛋白；可以使用穩定表達細胞系或原代細胞及干細胞進行試驗。

高Z'值和信號窗口

可以獲得更高的信噪比、更低的cv以及更穩定的assay。

通量高的同時上樣量少

可以兼容 96、384 或 1536 孔板的不同檢測模式，適合于微孔板樣品，樣品只需 5uL 或以下的體積。

本文中將 TREM2 和 DAP12 共同表達在 293T 細胞中共同表達，以此為平臺使用不同的脂類和蛋白類物質進行刺激，然后檢測其 Syk 的磷酸化水平的變化。

珀金埃爾默同時提供Phospho-Syk (Tyr352)和total Syk檢測試劑盒。

同時 ALPHA 新的技術也支持磷酸化蛋白和總蛋白同時檢測：

Phospho-Syk (Tyr352)和total Syk檢測試劑盒

長按識別下方二維碼，獲取詳細產品信息

Phospho-Syk (Tyr352)

total Syk

另外還有Syk的下游激活的PI3K、ERK、NFκB等信號通路，根據具體環境，這些信號轉導級聯可差異性和協同性參與，從而影響各種小膠質細胞功能，包括受體介導的吞噬、β-catenin 和 mTOR 復合體 1 介導的轉錄調控、通過 PIP 2/3 介導的 AKT 和 mTOR 復合體 2 激活實現的代謝平衡、導致促炎性分子轉錄調控的 RAS/MEK/ERK 激活，以及導致肌動蛋白重構的鈣調節。除了這些信號通路以外神經退行性疾病也會導致 Tau 蛋白等的磷酸化水平發生變化。這些變化都可以通過 ALPHA surefire ultra 的平臺進行定量檢測。