摘要

目前還沒有獲得美國食品和藥物管理局許可的預防埃博拉病毒(EBOV)感染的疫苗。 目前正在開發的埃博拉病毒候選疫苗，以及目前大多數獲得許可的疫苗，都需要在連續冷鏈下運輸和儲存，以防止產品效力下降。 冷鏈需求在發展中國家特別難以滿足。 為了提高熱穩定性和降低昂貴的冷鏈需求，使用凍干技術將一種對抗埃博拉病毒的亞單位蛋白疫苗配制成玻璃狀固體。 將添加微顆粒氫氧化鋁的關鍵抗原——埃博拉糖蛋白(EBOV-GP)配制成液體和凍干形式，并將疫苗在40°C條件下孵育12周。 在12周的潛伏期期間，在液體制劑中觀察到EBOV-GP的聚集和降解，而在凍干制劑中變化很小。 在BALB/c小鼠肌肉內三次免疫后，對EBOV-GP的抗體反應測定疫苗的免疫原性。 EBOV-GP制劑在液體和凍干形式中具有同等的免疫原性。 經過凍干和重組，添加佐劑的疫苗制劑在小鼠體內產生的抗ebov - gp IgG抗體反應與相應的添加佐劑的液體疫苗制劑產生的抗體反應相似。 更重要的是，注射40°C孵育12周的重組凍干疫苗制劑小鼠的抗體反應表明，高溫儲存后疫苗的免疫原性*保留，為未來疫苗開發工作提供了希望。  

背景介紹

埃博拉病毒病(EVD)是一種致命的病毒性疾病，最早于1976年在剛果民主共和國被報道。 過去50年來，埃博拉病毒病在多個非洲國家零星爆發。 最大規模的疫情是2014年至2016年在塞拉利昂、幾內亞和利比里亞爆發的疫情，期間共確診28616例埃博拉病毒病，導致11310人死亡。 目前還沒有獲得許可的埃博拉病毒疫苗。 因此，埃博拉病毒疫苗是全世界研究工作的主題。 一些候選疫苗在動物模型中顯示出了希望，一些主要通過病毒載體傳播的EBOV候選疫苗的人體臨床試驗結果已被報道。 從疫苗的制造到運輸和儲存，必須控制疫苗所暴露的溫度，通常都是在很窄的范圍內，以保持其效力。 例如，由默克公司開發的EBOV主要候選疫苗VSV-ZEBOV，在塞拉利昂、幾內亞和利比里亞進行了測試，目前用于剛果民主共和國正在爆發的疫情，需要在- 60至- 80°C之間持續儲存。 據報道，Janssen疫苗公司正在開發的埃博拉疫苗Ad26-ZEBOV在40°C的注射器中可穩定保存6小時，但在25°C的注射器中保存3個月后，藥品的效價受到“顯著影響"。 在低收入和中等收入國家，包括有埃博拉疫情歷史的國家，維持這些“冷鏈"需求成本高昂，尤其困難。 此外，由于冷鏈的要求，為未來疫情準備的潛在庫存所需的物流配置變得更加復雜。 因此，我們需要一種抗埃博拉病毒疾病的耐熱疫苗，這種疫苗可以消除對連續冷鏈的需求。  

凍干法常用于穩定治療用蛋白制劑。 在這個過程中，首先將含有蛋白質和玻璃化輔料(如海藻糖或蔗糖)的液體溶液冷凍，在冷凍濃縮輔料的玻璃狀基質中形成細小的冰晶懸浮液。 然后，在真空下通過升華去除冰，理想情況下留下一個固體的玻璃狀基質，治療性蛋白被嵌入其中。 這種玻璃狀固體基質中的分子運動受到高度限制，這抑制了需要大量分子運動的降解途徑，如蛋白質聚集。 配方的凍干蛋白配方可以在較長時間內保持穩定(例如，至少18-24個月)，甚至在室溫下也可以。 

為了使其具有足夠的免疫原性，基于亞單位蛋白抗原的疫苗通常需要添加佐劑，如微顆粒氫氧化鋁懸浮液。 這是一個挑戰，因為這些疫苗的配方必須保證足夠的穩定性，不僅對蛋白質抗原，而且對任何添加的佐劑。 佐劑蛋白亞單位疫苗制劑的常規凍干是有問題的，因為最初的冷凍步驟可能會破壞佐劑懸浮液的穩定性。 用微粒佐劑作為佐劑的疫苗配方的冷凍尤其成問題，因為微粒懸浮液的冷凍會引起團聚并導致疫苗效力的喪失。 在冷凍過程中，純冰晶體形成，濃縮佐劑、抗原和任何添加的溶質(如鹽和緩沖液)的剩余懸浮液，有時倍數為15-20倍或更多。 高濃度懸浮的佐劑顆粒、高離子強度和潛在的冷凍引起的pH值變化的結合會使佐劑懸浮不穩定，導致不可接受的顆粒團聚。  

我們已經表明,freezing-induced擾動的氫氧化鋁懸浮液可以最小化通過配方和凍干工藝條件,降低的程度freezing-induced濃度以及制定的時間花在冷凍濃縮液體狀態。 首先，我們將含有相對高濃度(如9.5 wt%)玻璃形成劑海藻糖的溶液凍干。 在凍結過程中，海藻糖最大濃縮到約76 wt%，因此9.5%的起始濃度限制了所有溶質可能的凍結濃度增加約8倍。 其次，我們用醋酸銨作為緩沖液。 由于乙酸銨具有揮發性，在凍干過程中會蒸發，進一步降低了冷凍濃縮對離子強度的影響。 最后，通過使用預冷式冷凍干燥機貨架和快速冷凍干燥機貨架冷卻速度，我們限制了初始凍結和液體達到玻璃化轉變溫度之間的時間，從而最大限度地減少了由冷凍濃度引起的氫氧化鋁顆粒團聚。  

在本研究中，我們應用了這些凍干配方和加工策略，以減少在一種使用昆蟲細胞表達的EBOVGP作為抗原的耐高溫、氫氧化鋁佐劑亞單位蛋白疫苗中凍干引起的氫氧化鋁團聚現象。 僅含該抗原的疫苗配方對感染埃博拉病毒的小鼠模型具有保護作用; 這些保護性反應在含有佐劑的配方中增加。 為了測試配方的熱穩定性，將疫苗在40°C孵育12周，并采用各種生物物理技術進行表征。 用各種EBOV-GP疫苗配方肌內免疫BALB/c小鼠后產生的抗體反應來量化所測試疫苗配方的相對免疫原性。  

材料

疫苗抗原EBOV-GP是在夏威夷大學生產的，如前所述。 氫氧化鋁佐劑(Alhydrogel®2%)來自Brenntag Biosector (Frederikssund，丹麥)。 考馬西®亮藍G-250購自MP Biomedicals LLC (Solon, Ohio)。 使用Bio-Rad實驗室(Hercules, CA)的PROTEAN®TGX™凝膠。 Anti-EBOV GP小鼠/人嵌合單克隆抗體(c13C6 FR1)購自IBT Bioservices (Gaithersburg, MD)，堿性磷酸酶Affini-純山羊抗人IgG, Fcγ片段特異性購自Jackson免疫研究實驗室(West Grove, PA)。 乙酸銨、三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸和磷酸鈉購自Sigma Aldrich(圣路易斯，MO)。 海藻糖來自Pfanstiehl, Inc. (Waukegan, IL)。 材料來自Thermo Fisher Scientific (Walthan, MA)，包括*，丙烯酰胺，硝基藍四唑(NBT)， 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽(BCIP)，注射用HyClone™水，10×磷酸鹽緩沖鹽溶液(10XPBS)，含1.37M氯化鈉，0.027M氯化鉀和0.19 m磷酸鹽。 FIOLAX®玻璃瓶(3ml)取自Schott(黎巴嫩，PA)。 丁基橡膠凍干塞(13毫米)購自Kimble Chase Life Science and Research Products, LLC (Vineland, NJ)，鋁密封件購自West Pharmaceutical Services, Inc. (Exton, PA)。 用于動物注射，非硅化HSW規范- ject®無菌1- mL注射器(Henke Sass Wolf, Tuttlingen，德國)和BD™25G 5/ 8英寸。 使用無菌針頭(Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA)。 黃花™動物柳葉刀(Medipoint Inc.， Mineola, NY)用于下頜下出血，血液收集在高壓釜1.7 mL聚丙烯管。

液體疫苗配方

疫苗配方由0.1 mg/mL EBOV-GP、10mM乙酸銨和9.5% (w/v)海藻糖組成，pH為7。 EBOV-GP在10mM乙酸銨中儲存在- 80°C，儲存濃度為1.3 mg/mL。 使用前，將EBOV-GP原液在室溫下解凍，以10000 g離心5分鐘，以去除凍結和解凍原液中可能存在的任何不溶性蛋白聚集物或其他顆粒。 將離心后的EBOV-GP原液上清液用含12% (w/v)海藻糖的10mM乙酸銨和足夠量的10mM乙酸銨稀釋，得到0.1 mg/mL EBOV-GP液體疫苗制劑的終濃度為10mM乙酸銨和9.5% (w/v)海藻糖。 一些疫苗配方中添加了微顆粒氫氧化鋁，Alhydrogel®。 在這些配方,2%的懸浮液Alhydrogel®(10毫克/毫升)抗原原液含有1.3毫克/毫升EBOV-GP在10毫米醋酸銨,12%海藻糖在10毫米醋酸銨的溶液,和足夠的10毫米醋酸銨被添加到1.6毫升聚丙烯離心管產量最終配方含0.1毫克/毫升EBOV-GP, 在9.5mM乙酸銨中添加0.5 mg/mL鋁和9.5%海藻糖。 在4°C的條件下，將這些配方端到端旋轉1小時，以使EBOV-GP吸附在氫氧化鋁顆粒上。 溶液用無菌水配制，用于制備緩沖液和蛋白制劑的容器用高壓滅菌器或購買的無菌設備滅菌。 2%的Alhydrogel®是無菌購買的，使用無菌技術從瓶子中取出等分。 對于未凍干的疫苗制劑，將1ml液體疫苗制劑配制成3ml玻璃瓶，加塞，并用鋁蓋密封。 在給藥之前，這些液體疫苗制劑在4°C保存，或在40°C孵育12周。  

疫苗配方的凍干和重組

FTS系統LyoStar凍干機(Warminster, PA)用于疫苗制劑的冷凍干燥。 EBOV-GP制劑使用的配方賦形劑和凍干循環與Hassett等人使用的基本相同。將凍干機格架預冷至?10°C。 3毫升FIOLAX®玻璃小瓶(Schott，黎巴嫩，PA)裝滿了1毫升各種液體疫苗配方，小瓶的中間放置了小瓶塞子。 然后將小瓶放置在凍干機樣品室的預冷架子上。 為了盡量減少由于輻射和邊緣瓶效應而對單個瓶的熱傳遞的變化，裝有試驗疫苗配方的樣品瓶被裝滿水[34]的瓶子包圍。 在凍干循環的冷凍階段，凍干機的貨架溫度以0.5°C/min的速度下降到- 40°C，然后在- 40°C保持1小時，以確保瓶內內容物*冷凍。 將凍干機壓力降至8 Pa開始一次干燥，架子溫度以1°C/min的速度升高至?20°C，并保持20 h。 壓力持續控制在8 Pa同時二次干燥開始通過增加凍干機擱板溫度0°C的速度0.2°C /分鐘,其次是增加到30°C 0.5°C /分鐘,溫度5 h舉行。在周期的結束, 在凍干機中回充過濾后的氮氣，直至達到常壓狀態，在充滿氮氣的凍干室中，通過手動折疊凍干機架子將瓶塞從半程位置移動到*插入、密封的位置，自動密封小瓶。 密封的小瓶從凍干機中取出后，小瓶瓶塞用鋁蓋固定。 部分凍干疫苗在40°C保存12周; 未經過高溫儲存的凍干疫苗制劑在使用前保持在- 80°C。 在給小鼠使用之前，將凍干疫苗配方與所需的注射用水(WFI)進行重組，以獲得1.0 mL的總體積。重組疫苗配方輕輕混合，并在試驗前在實驗臺上放置至少30分鐘。 另一種疫苗配方包括一種重組的凍干疫苗配方，其中在凍干和重組后加入氫氧化鋁微粒。 該制劑在凍干制劑中加入注射用水，然后加入氫氧化鋁懸浮液，最終濃度為0.5 mg/mL氫氧化鋁，總體積為1.0 mL。 采用與含氫氧化鋁的液體配方相同的方法，將配方從小瓶轉移到1.6 mL的聚丙烯離心管中，并在4°C下端對端旋轉1小時，以使EBOVGP吸附在氫氧化鋁顆粒上，然后進行測試。  

使用流式顆粒成像技術FlowCam®( Fluid Imaging Technologies, Scarborough, ME)獲得微米級范圍內的顆粒濃度和數字加權粒度分布。 在分析前對凍干配方進行重組，并在3個重復中進行測量。 

在含有氫氧化鋁的配方的色譜圖中沒有檢測到可溶性蛋白，這表明基本上所有的EBOVGP都被吸附到顆粒上(數據未顯示)。 使用FlowCam®監測配方中的不溶性蛋白質和氫氧化鋁顆粒。 液體EBOV-GP、凍干EBOV-GP和重組EBOV-GP中氫氧化鋁顆粒的平均直徑分別為2.7±0.1 μm和4.7±0.1 μm。 這表明在凍干和/或重建過程中發生了一些氫氧化鋁的團聚。 然而，凍干和重組后的平均直徑遠低于報道的佐劑活性的上限10 μm。  

注射液體形式的EBOV-GP疫苗制劑的小鼠和注射重組凍干形式的EBOV-GP疫苗制劑的小鼠產生了類似的針對EBOV-GP的IgG抗體反應，表明液體和凍干配方具有相同的免疫原性。 此外，在重組和注射前在40°C孵育12周的凍干疫苗配方小鼠的抗體應答與未孵育的凍干疫苗配方小鼠的應答相似。 因此，凍干EBOV-GP疫苗配方在接近埃博拉暴發地區最高環境溫度的溫度下儲存12周后，免疫原性并不下降。  

在40°C條件下孵育12周后，液體制劑中EBOV-GP的聚集狀態發生改變，而凍干制劑中只出現很小的變化。 因此，我們預計液體制劑在40°C孵育后免疫原性會相應下降。 然而，在40°C下培養含鋁羥基佐劑的液體EBOV-GP配方12周并沒有降低對EBOV-GP的抗體反應。 用構象敏感的c13C6抗體和SE-HPLC進行Western blotting顯示，該制劑中EBOV-GP的組裝狀態發生了變化，但抗體反應對這種物理降解不敏感。 構象敏感的c13C6抗體也與降解產物結合，因此被認為是具有適當免疫原性的關鍵抗原表位似乎在降解的蛋白組分中保留了下來。 這與熒光猝滅結果一致，表明EBOV-GP保留了近天然的三級結構。 注射了含氫氧化鋁的凍干疫苗的小鼠在第35天第2次劑量后和第56天第3次劑量后抗ebov - gp IgG MFI值相似。 對這些結果的一種解釋可能是，在研究中使用的10 μg劑量時，免疫反應達到飽和，因此只需要最初存在的一小部分EBOV-GP就可以產生顯著的抗體反應。  

正如預期的那樣，含有常見疫苗佐劑氫氧化鋁的EBOV-GP疫苗配方比不含佐劑的EBOV-GP疫苗配方更具有免疫原性。 冷凍通常會導致氫氧化鋁顆粒聚集，在疫苗配方中產生直徑可達10-100 μm的顆粒。 這些冷凍誘導的佐劑顆粒尺寸增加的影響仍然存在爭議。 冷凍可導致疫苗失效。 一項研究表明，鋁鹽佐劑顆粒在冷凍和干燥過程中的團聚是導致這種冷凍引起的免疫原性損失的原因，但在隨后的研究中，檢查了鋁鹽佐劑疫苗的凍融穩定性， 免疫反應并沒有因為冷凍引起佐劑粒徑分布的變化而改變。 無論冷凍誘導的佐劑團聚是否會改變免疫原性，疫苗配方中存在大團聚不大可能在藥學上是可接受的。  

在本研究中，凍干后的顆粒平均直徑小于5 μm，可能是因為配方中9.5%海藻糖的存在抑制了團聚。 這些結果與Clausi等人的研究結果一致，他們發現高濃度的無定形成型輔料可以減少氫氧化鋁在凍干過程中的聚集。 此外，我們的研究發現，在稀釋液中凍干后加入氫氧化鋁的重組凍干疫苗配方注射小鼠的抗體反應與在凍干前加入氫氧化鋁的配方注射小鼠的抗體反應相同。 這表明，盡管添加了氫氧化鋁的EBOV疫苗配方在凍干循環過程中受到了冷凍，但冷凍引起的氫氧化鋁懸浮液的變化很小，不會影響疫苗的免疫原性。  

開發穩定的凍干埃博拉疫苗配方可以大大減少冷鏈需求。 盡管我們測試的液體配方和凍干配方的免疫反應是相同的，但在40°C條件下培養后在液體配方中觀察到的EBOV-GP蛋白的物理降解可能會限制液體配方在缺乏嚴格冷鏈要求的情況下的可接受性， 促進凍干制劑的使用。 然而，應該指出的是，凍干配方帶來了額外的挑戰，如需要現場重組和需要單獨的稀釋劑瓶，這需要額外的存儲空間，或雙筒注射器內的凍干，這增加了成本。  

總結

液體EBOVGP制劑在高溫孵育后，蛋白質組裝狀態顯著降解，而凍干制劑的蛋白質組裝狀態變化最小。 我們的研究結果表明，與液體EBOV-GP配方相比，凍干不會降低疫苗在小鼠中的免疫原性。 此外，注射重組凍干疫苗配方(注射前在高溫下孵育12周)的小鼠的抗體反應與注射未在高溫下孵育的重組凍干疫苗配方的小鼠的抗體反應相似。 說明高溫貯存后疫苗免疫原性無損失。 凍干EBOV-GP疫苗配方具有耐熱性，并有可能在分發和儲存期間消除對冷鏈的需要。 有希望的結果導致繼續研究EBOV GP和其他絲狀病毒候選疫苗的熱穩定性。