檢測方法	二級偶聯(lián)物	基質(zhì)	考慮
增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（ECL）	辣根過氧化物酶	基于魯米諾的ECL檢測解決方案	基于 HRP 的系統(tǒng)通常更靈敏且更易于使用
增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（ECL）	堿性磷酸酶（AP）	基于吖啶和1,2-二氧雜環(huán)丁烷的ECL檢測解決方案	基于 HRP 的系統(tǒng)通常更靈敏且更易于使用
顯色	辣根過氧化物酶	3,3'，5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、氯-1-萘醇（4CN）或 3,3'-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）	通常靈敏度低于ECL，更難使用。允許多路復(fù)用。
顯色	堿性磷酸酶（AP）	硝基藍(lán)四唑（NBT）或5-溴-4-氯吲哚磷酸酯（BCIP）	通常靈敏度低于ECL，更難使用。允許多路復(fù)用。
熒光	熒光基團(tuán)（例如Alexa Fluor 680）	那	多路復(fù)用和信號的持續(xù)時間可以比 ECL 更長

表 1.蛋白質(zhì)免疫印跡檢測方法摘要

4.1.1 增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光

增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（ECL）利用辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）偶聯(lián)的二抗來催化產(chǎn)生光的反應(yīng)。這是通過過冷CCD傳感器或X射線膠片檢測的，可以可視化印跡。

HRP偶聯(lián)次級因其即時信號生成和比AP偶聯(lián)次級更高的靈敏度而被*廣泛使用。使用AP偶聯(lián)副反應(yīng)時的另一個考慮因素是它們與磷酸鹽緩沖液不兼容。HRP被疊*化鈉（一種常用的防腐劑）抑制，因此不應(yīng)與含有NaN的溶液一起使用3.

由于僅發(fā)射單一波長的光，因此不可能進(jìn)行多重檢測，除非蛋白質(zhì)靶標(biāo)以不同的分子量存在，從而可以在同一膜上同時探測多個靶標(biāo)（例如見圖2）。如果多個靶標(biāo)的分子量相似，則需要剝離并重新探測印跡。

圖2.使用抗體檢測不同分子量靶標(biāo)的ECL示例。使用小鼠單克隆抗NFL抗體（HB6433）和小鼠單克隆抗GAPDH（HB9177）探測從各種組織裂解物轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)的膜。使用與HRP偶聯(lián)的山羊抗小鼠多克隆抗體完成可視化。由于NFL和GAPDH的分子量不同，這使得多路復(fù)用變得容易。NFL和GAPDH的不同信號強(qiáng)度需要不同的曝光時間，這意味著每個目標(biāo)都需要單獨的面板。

4.1.2 顯色檢測

顯色檢測利用HRP和AP偶聯(lián)抗體催化反應(yīng)，導(dǎo)致沉淀到膜上的有色最終產(chǎn)物。HRP的常見底物有：

3,3'，5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）：產(chǎn)生具有高信噪比的藍(lán)色產(chǎn)品
氯-1-萘醇（4CN）：產(chǎn)生紫藍(lán)色產(chǎn)品。但是穩(wěn)定性和靈敏度的問題
3,3'-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）：產(chǎn)生棕色產(chǎn)品，可使用金屬離子增強(qiáng)。但是穩(wěn)定性有問題。

AP 的常見基板有：

硝基藍(lán)四唑（NBT）/5-溴-4-氯吲哚磷酸酯（BCIP）：產(chǎn)生強(qiáng)烈的紫色產(chǎn)品，耐褪色。

AP反應(yīng)可以通過與酸性溶液孵育來停止，因此允許與不同顏色的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行多重反應(yīng)。然而，AP共軛次級器件通常不如HRP檢測系統(tǒng)敏感，因此使用頻率要低得多。HRP被疊*化鈉（一種常用的防腐劑）抑制，因此不應(yīng)與含有NaN的溶液一起使用3.

4.1.3 熒光檢測

熒光檢測利用熒光團(tuán)偶聯(lián)的二抗來檢測蛋白質(zhì)條帶。由于PVDF在較低波長下自發(fā)熒光，用于WB檢測的熒光團(tuán)往往具有高度紅移。ICC/IHC和WB中常用的熒光團(tuán)列表詳見表1。請參閱成像系統(tǒng)規(guī)格，查找熒光團(tuán)與激發(fā)/發(fā)射波長兼容的組合。

與ECL相比，熒光檢測的靈敏度較低，但通過使用具有足夠不同的激發(fā)/發(fā)射波長的熒光團(tuán)可以輕松進(jìn)行多重檢測。隨著時間的推移，熒光信號也比ECL信號更穩(wěn)定，允許輕松重新成像，同時比ECL檢測變化更小，因為它不依賴于可能受多種因素影響的酶促反應(yīng)。

4.2 免疫組織化學(xué)/免疫細(xì)胞化學(xué)

免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)利用熒光或顯色介導(dǎo)的檢測。方法之間的選擇將取決于樣品制備、實驗?zāi)繕?biāo)和設(shè)備可用性（概述見表2和圖3）。

檢測方法

二級偶聯(lián)物

優(yōu)勢

弊

顯色

辣根過氧化物酶

堿性磷酸酶（AP）

通過信號放大實現(xiàn)更高的靈敏度

最終產(chǎn)品穩(wěn)定性更高，允許更長的載玻片存儲時間

更耗時

更難多路復(fù)用

熒光

熒光基團(tuán)（例如Alexa Fluor 488或DyLight 594）

輕松多路復(fù)用

更快的實驗方案

高動態(tài)范圍

信號僅在幾天內(nèi)穩(wěn)定

某些組織中可能存在自發(fā)熒光問題。

熒光團(tuán)可以光漂白

表 2.免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)檢測方法概述。

圖3.可用于免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)的檢測方法概述

4.2.1 熒光介導(dǎo)檢測

熒光介導(dǎo)檢測因其高度的靈活性和易于多路復(fù)用而非常受歡迎（例如參見圖4）。這種易于多路復(fù)用也使熒光檢測適用于共定位蛋白的分析。為免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)選擇熒光團(tuán)/熒光團(tuán)對的第一步是檢查將用于成像的顯微鏡的規(guī)格。寬視場顯微鏡通常只配備有限的激發(fā)和發(fā)射濾光片，這將限制熒光團(tuán)的選擇，而共聚焦顯微鏡通常受到可用于激發(fā)的激光通道數(shù)量的限制。激發(fā)和發(fā)射濾光片的激發(fā)和發(fā)射波長范圍需要與熒光團(tuán)的激發(fā)和發(fā)射光譜重疊。有關(guān)IHC/ICC中常用熒光團(tuán)（包括復(fù)染劑）的列表，請參見表3。

圖4.使用熒光檢測的免疫細(xì)胞化學(xué)示例。小鼠單克隆抗NFL抗體（HB6433）與DyLight 488偶聯(lián)多克隆山羊抗小鼠二抗配對，用于檢測利用DAPI（HB0747）作為復(fù)染劑的培養(yǎng)大鼠神經(jīng)元中的神經(jīng)絲，以可視化DNA。

Dye	Maximal absorbance wavelength (nm)	Maximal emission wavelength (nm)	Visible Colour
Alexa Fluor 350	346	442	Blue
Hoechst 33342	350	461	Blue
Hoechst 33258	352	461	Blue
DyLight 350	353	432	Blue
DAPI	358	461	Blue
DyLight 405	400	420	Blue
Alexa Fluor 405	401	421	Blue
Alexa Fluor 430	433	541	Green / Yellow
EGFP	488	507	Green
Cy2	489	506	Green
FITC	492	520	Green
DyLight 488	493	518	Green
Alexa Fluor 488	496	519	Green
Alexa Fluor 532	532	553	Yellow
Cy3	550	570	Yellow
Alexa Fluor 546	556	573	Orange
Alexa Fluor 555	555	565	Orange
DyLight 550	562	576	Orange
TRITC	557	576	Orange
Alexa Fluor 568	578	603	Orange / Red
Cy3.5	581	594	Orange / Red
mCherry	587	610	Red
Texas Red	589	615	Red
Alexa Fluor 594	590	617	Red
DyLight 594	593	618	Red
Alexa Fluor 610	612	628	Red
Alexa Fluor 633	632	647	Far Red
DyLight 633	638	658	Far Red
Alexa Fluor 635	633	647	Far Red
DRAQ5	646	697	Far Red
Alexa Fluor 647	650	665	Far Red
Cy5	650	670	Far Red
DyLight 650	652	672	Far Red
Alexa Fluor 660	663	690	Far Red
Cy5.5	675	694	Far Red
Alexa Fluor 680	679	702	Near Infrared
IRDye 680	680	694	Far Red
IRDye 700	680	697	Far Red
DyLight 680	692	712	Near Infrared
Alexa Fluor 700	702	723	Near Infrared
Cy7	743	767	Near Infrared
Alexa Fluor 750	749	775	Near Infrared
DyLight 755	754	776	Near Infrared
IRDye 750	766	776	Near Infrared
DyLight 800	777	794	Near Infrared
Alexa Fluor 790	784	814	Near Infrared
IRDye 800RS	770	794	Near Infrared
IRDye 800CW	778	786	Near Infrared

表 3.熒光免疫組化和免疫細(xì)胞化學(xué)常用的一些熒光團(tuán)和復(fù)染劑總結(jié)

通過使用具有不同激發(fā)/發(fā)射光譜的成對熒光團(tuán)來實現(xiàn)多路復(fù)用。在選擇熒光團(tuán)對時，確保它們沒有重疊的激發(fā)/發(fā)射光譜至關(guān)重要（參見圖5，了解用于多重檢測的熒光團(tuán)成功組合的示例）。如果熒光團(tuán)的發(fā)射光譜重疊，則通道可能會滲入另一個通道，從而難以分辨來自哪種抗體的信號。雖然一些**的分析軟件能夠糾正這一點，但僅使用一個熒光基團(tuán)的對照通常很有幫助，以便可以輕松檢測滲漏。

圖 5：用于多重實驗的合適熒光團(tuán)組合示例。激發(fā)和發(fā)射光譜之間的重疊最小，這意味著成像時信號不太可能在通道之間滲漏。

4.2.2 顯色檢測

顯色檢測利用堿性磷酸酶（AP，使用 3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）作為底物）或辣根過氧化物酶（HRP，使用 3,3' 二氨基聯(lián)苯胺（DAB）作為底物）介導(dǎo)的反應(yīng)催化，導(dǎo)致有色底物沉積在組織切片上。由于這種彩色基材不會降解，這意味著載玻片可以保存數(shù)月而不會明顯損失信號強(qiáng)度。由于酶反應(yīng)充當(dāng)擴(kuò)增步驟，顯色檢測具有很高的靈敏度，但是除非靶標(biāo)位于不同的細(xì)胞類型或位置，否則很難進(jìn)行多重檢測。在這種情況下，可以使用具有不同反應(yīng)產(chǎn)物的底物成功多重。

5. 三級檢測

當(dāng)靶標(biāo)以低豐度表達(dá)或其檢測存在其他問題時，一種可能性是使用三級檢測系統(tǒng)。這些利用鏈霉親和素和生物素之間的*高親和力，在免疫化學(xué)過程中增加了另一個步驟。三級檢測使用生物素偶聯(lián)的二抗，然后由熒光團(tuán)或酶偶聯(lián)的鏈霉親和素結(jié)合。這增加了一個額外的擴(kuò)增步驟，因此在以前使用其他檢測方法的實驗不成功的情況下非常有用。

如何選擇二抗

1. 概述

2. 選擇正確的目標(biāo)和物種

3. 凈化

4. 如何選擇合適的偶聯(lián)物

4.1 蛋白質(zhì)印跡