液相色譜對于多數人來說都是很好上手的儀器了，但是就算是用過幾年、經驗豐富的分析員都會習慣于一些錯誤的操作，經常導致一些儀器故障。方便快捷的分析過程固然重要，但是為了多做樣品而忽略了一些該有的步驟，往往得不償失，哪些操作不能做？哪些懶兒不能偷？那些小概率的故障師傅沒教怎么辦？液相使用過程中有哪四大關鍵因素要注意？

一、流動相不過濾

 因為塵埃或其它任何雜質微粒都會磨損柱塞、密封環、缸體和單向閥，因此應預先除去流動相中的任何固體微粒。流動相最好在玻璃容器內蒸餾，而常用的方法是濾過，可采用Millipore濾膜（0.2μm或0.45μm）等濾器。泵的入口都應連接砂濾棒（或片）。輸液泵的濾器應經常清洗或更換。

二、使用后沒有及時清洗泵
   

流動相不應含有任何腐蝕性物質，含有緩沖液的流動相不應保留在泵內，尤其是在停泵過夜或更長時間的情況下。如果將含緩沖液的流動相留在泵內，由于蒸發或泄漏，甚至只是由于溶液的靜置，就可能析出鹽的微細晶體，這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞密封環和柱塞等。因此，必須泵入純水將泵充分清洗后，再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護的溶劑（對于反相鍵合硅膠固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。

三、流動相走空

泵工作時要留心防止溶劑瓶內的流動相被用完，否則空泵運轉也會磨損柱塞、缸體或密封環，最終產生漏液。沒有流動相流出，又無壓力指示怎么辦？
可能是泵內有大量氣體，這時可打開泄壓閥，使泵在較大流量（如5ml/min）下運轉，將氣泡排盡，也可用一個50ml針筒在泵出口處幫助抽出氣體。另一個可能原因是密封環磨損，需更換。

四、壓力和流量不穩了？

原因可能是氣泡，需要排除；或者是單向閥內有異物，可卸下單向閥，浸入丙酮內超聲清洗。有時可能是砂濾棒內有氣泡，或被鹽的微細晶粒或滋生的微生物部分堵塞，這時，可卸下砂濾棒浸入流動相內超聲除氣泡，或將砂濾棒浸入稀酸（如4mol/L硝酸）內迅速除去微生物，或將鹽溶解，再立即清洗。
壓力為啥過高或過低？
可能是是管路被堵塞，需要清除和清洗。壓力降低的原因則可能是管路有泄漏。檢查堵塞或泄漏時應逐段進行。在進行梯度洗脫時，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變化，因此帶來一些特殊問題，必須充分重視。

PS：在液相色譜中對組分復雜的樣品采用梯度洗脫的方法。在同一個分析周期中，按一定程序不斷改變流動相的濃度配比，稱為梯度洗脫。從而可以使一個復雜樣品中的性質差異較大的組分能按各自適宜的容量因子k達到良好的分離目的。

梯度洗脫的優點：1.縮短分析周期；2.提高分離能力；3.峰型得到改善，很少拖尾；4.增加靈敏度。但有時引起基線漂移。

五、梯度洗脫的流動相選擇不當
    

要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相。有些溶劑在一定比例內混溶，超出范圍后就不互溶，使用時更要引起注意。當有機溶劑和緩沖液混合時，還可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時需特別小心。

六、忽略的空白梯度洗脫

梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證良好的重現性。進行樣品分析前必須進行空白梯度洗脫，以辨認溶劑雜質峰，因為弱溶劑中的雜質富集在色譜柱頭后會被強溶劑洗脫下來。用于梯度洗脫的溶劑需要脫氣，以防止混合時產生氣泡。

七、忽略了溶劑混合所帶來的粘度變化

混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時常出現壓力的變化。例如甲醇和水粘度都較小，當二者以相近比例混合時粘度增大很多，此時的柱壓大約是甲醇或水為流動相時的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱能承受的最大壓力。

八、關于六通閥的正確使用和維護

①樣品溶液進樣前必須用0.45μm濾膜過濾，以減少微粒對進樣閥的磨損。
②轉動閥芯時不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流動相受阻，使泵內壓力劇增，甚至超過泵的最大壓力；再轉到進樣位時，過高的壓力將使柱頭損壞。
③為防止緩沖鹽和樣品殘留在進樣閥中，每次分析結束后應沖洗進樣閥。通常可用水沖洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水沖洗。

九、關于色譜柱的使用和維護

色譜柱的正確使用和維護十分重要，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護色譜柱。

調節流速太快。。。
避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內填料，因此在調節流速時應該緩慢進行，在閥進樣時閥的轉動不能過緩（如前所述）。

反沖色譜柱。。。
一般說來色譜柱不能反沖，只有生產者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質。否則反沖會迅速降低柱效。
預柱和保護柱。。。
選擇使用適宜的流動相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一預柱，分析柱是鍵合硅膠時，預柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質被溶解。
避免將基質復雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內，需要對樣品進行預處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應該經常更換。

十、【來自前輩的經驗】小概率故障如何排除？
【1】泵壓跳動，跳動范圍10bar左右。。。
解決方法：
1、原先小白頭有點臟，更換后尚未解決；
2、將主動閥上的閥芯取出后，發現有類似氣泡存在，浸入甲醇-水溶液超聲5min，以試著去除氣泡，重新將其安裝后再觀察，仍未解決；
3、更換新的閥芯，將其安裝后，不再有跳動，觀察一段時間后比較平穩，成功解決。
【2】發生故障：①plug homing over pressure
② 灌注及設流速時均無壓力也不見液體流出
③檢測器光閘不能復位④進完大濃度樣品后，進空白相應位置也出峰。。。
可能原因：①在線過濾器堵了
②泵頭下單向閥堵了
③有可能是檢測池臟了，也有可能是光路有點堵，再不行可能是燈壽命到了
④小抹布臟了，需要換
解決方法：
①在線過濾器卸下來，置燒杯，加純化水煮沸5-10分鐘后甲醇超一下一般就可以了，如果還堵的話就拿稀硝酸泡，還不行的話就換新的了，這本身是個消耗品
②把泵頭下單向閥卸下來，兩個都有可能堵，剛卸下來時豎著在耳邊搖一搖是聽不到聲音的。簡單的拿洗耳球把單向閥吹吹就行了（注意方向），吹了沒反應可以拿溶劑超聲，但不可水煮，一般超至在耳邊搖能聽見聲音就不影響實驗
③先用溶劑把檢測池沖沖，用啥試具體樣品而定；若沖了還不行，把檢測池卸下，看燈能量，若能量還可以（有個幾千），可能得清洗光路了。第一次清洗的話建議還是叫工程師來，因為待清理的部件在檢測器的最下方，有一個黑色片片，中間有一條縫，而且那一塊的螺絲都是八角的，卸起來很麻煩。
④把5個樣品盤都拿出來，可以看見里面有一個黑色突起（看不清用手電筒），平時進樣針就是從那個地方吸樣的。手伸進去就可以卸下來，里面有一個小白圈圈（用多了自然就黑了），換一個新的就行了，買儀器時一般配有10個。

液相色譜在使用過程中的四大關鍵因素

1.液相色譜儀本身：

對于儀器本身一般不會有問題，特別是剛買回來的新儀器。對于儀器本身最重要的就是儀器的校驗，剛買回來的儀器一般都是由賣家先對儀器做系統的確認工作（包括IQ、PQ、OQ），確認順利通過后，再請國家或省級儀器檢定局的來校驗，檢定合格后就可以放心使用了，除此之外，一些做得好的公司每半年會對儀器進行一次的內部校驗，目的就是為了保證儀器的正常可運行狀態。

2. 色譜條件：
  色譜條件一般包括流動相、色譜柱、檢測波長、流速及進樣量。流動相就涉及到配制流動相所用到的水和試劑試液，水一般要求用超純水或其他水的電阻率不大于18.2兆歐級別，試劑試液要求用色譜級別的，原因為防止水和試劑試液中的雜質對色譜結果的干擾。
色譜柱會因不同的品種而有不同的要求，但每根色譜柱都有它的清洗要求，這個在色譜柱說明書上都可以找到，一定要根據上面的要求進行，否則會造成色譜柱效下降和色譜柱的使用壽命縮短，檢測波長也會因品種的不同有不同的要求，這里需要指出的是要注意觀察檢測器氘燈能量的變化，比如基線波動大，活性成分的響應值突然變小等，都有可能是氘燈的能量不足所引起的，氘燈一般建議使用800小時，但實際上使用時間不止，可根據實際情況更換。流速也因品種的不同而不同，一般為1.0ml/min，流速是不可隨意改動的，特別是作為QC人員，但是作為研發人員，有時為了摸索條件或進行方法耐用性驗證，會對流速進行改變以評價方法的適用性。對于進樣量因不同的品種也有不同規定，進樣量這塊現在都使用自動進樣，所以進樣精密度都很好，不需強調什么。

3. 操作人員：
首先，作為液相操作人員，一定要認真學習夜想的說明書，掌握液相硬件和軟件的操作，掌握日常的維護保養，掌握最基礎故障的排除和維修。一般液相的操作規程也是有操作人員起草的，所以只要嚴格按照操作要求進行操作，一般不會出現問題，當然啫喱需要特別指出的是對于液相的日常維護保養很重要，比如流動相的過濾、脫氣、泵密封墊的清洗、系統管路的清洗、溶劑過濾頭的清洗等，倘若不堅持，很容易導致色譜柱堵塞、系統壓力過大、色譜峰異常等不必要的故障，浪費時間。其次，操作人員在配制液相分析用樣品溶液時，最好由同一個人單獨完成，以免不必要的偶然誤差。

4.液相安裝環境：
液相色譜儀應盡量安裝于水平、遠離振動、電磁干擾的屋內的臺面上，有條件的話盡量將液相數據處理系統分隔開，一個是防止色譜基線噪音偏大，基線不穩等，一個是為減少對人體的危害。