手機版
化工儀器網手機版
化工儀器網小程序
官方微信
公眾號：chem17
掃碼關注視頻號
氧化高密度脂蛋白對單核細胞膜脂流動性及淋巴細胞功能相關抗原-1表達的影響
摘 要］ 目的：研究氧化高密度脂蛋白（oxHDL）對單核細胞膜脂流動性及淋巴細胞功能相關抗原-1（LFA-1）表達的影響。方法：采用熒光探針DPH檢測膜脂流動性，用流式細胞術間接免疫熒光法檢測人單核細胞株THP-1細胞表面LFA-1的表達水平。結果：100 μg protein/mL的oxHDL和oxLDL（氧化低密度脂蛋白）作用20 h后可顯著降低THP-1細胞膜脂流動性（LFU），分別較對照組低45%和52%（P＜0.01）；oxHDL作用24 h可明顯促進LFA-1的表達，陽性細胞率和平均熒光強度分別較對照組高39%和45%（P＜0.01）。結論：oxHDL可能通過促進單核細胞表達LFA-1而使更多的單核細胞粘附于內皮，它還可降低單核細胞膜脂流動性，這將使單核細胞在進入內皮下層后難于重新返回循環血中，從而促進動脈粥樣硬化的發生。
Effects of oxidized high-density lipoprotein on membrane fluidity
and the expression of lymphocyte function associated antigen-1 of monocyte
HU Hou-yuan, CHEN Yun-zhen
（Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China）
［Abstract］ AIM: To investigate the effects of oxidized high-density lipoprotein （oxHDL） on membrane fluidity and the expression of lymphocyte function associated antigen（LFA-1） of monocyte. METHODS: The membrane fluidity of THP-1 cells was assayed by fluorescence anisotropy with DPH （1,6-dipheny-1,3,5-hexatriene）, a fluorescent probe; The LFA-1 expression on THP-1 cells were assayed by flow cytometry with indirect immunofluorescence.RESULTS: The membrane fluidity of THP-1 cells was reduced by 45% and 52% respectively （P＜0.01） after incubation with 100 μg protein/mL oxHDL and oxLDL for 20 h; oxHDL could stimulated the expression of LFA-1 on THP-1 cells, the positive cell rate and mean fluoresence intensity （MFI） increased by 39% and 45% respectively versus control group （P＜0.01） after incubation with cells for 24 h. CONCLUSIONS: By increasing the expression of LFA-1 on monocyte, oxHDL can promote the monocyte-endothelium adhesion; oxHDL also can reduce the membrane fluidity of monocyte, that will limit the returning of monocytes from subendothelium back to the circulation. This suggested that oxHDL may play an important role in atherogenesis.
［MeSH］ Lipoproteins, HDL; Monocytes; Membrane fluidity; Lymphocyte function-associated antigen-1
近年研究表明，高密度脂蛋白（high density lipoprotein, HDL）也易被氧化修飾而形成氧化高密度脂蛋白（oxidized high density lipoprotein, oxHDL）,oxHDL不僅轉運膽固醇的能力下降，而且具有細胞毒性作用，還可刺激內皮細胞釋放內皮素-1，并可被清道夫受體識別和攝取，從而有可能促進動脈粥樣硬化的發生［1～4］。本文進一步研究oxHDL對人單核細胞株THP-1細胞膜脂流動性及淋巴細胞功能相關抗原-1（lymphocyte function-associated antigen-1,LFA-1）表達的影響，以深入探討oxHDL在動脈粥樣硬化早期發生中的作用。
材 料 和 方 法
一、細胞培養
THP-1細胞由*上海細胞生物學研究所細胞庫提供。采用含10%小牛血清的RPMI 1640*培養基（含L-谷氨酰胺2 mmol/L、Hepes 10 mmol/L、青鏈霉素各100 U/mL），37℃、5%CO2孵箱中培養。實驗均采用復蘇后傳至第5代以上的細胞。
二、脂蛋白的分離和氧化修飾
采用一次性密度梯度超速離心法分離人血漿HDL（包括HDL2和HDL3）和LDL，氧化修飾采用Cu2＋介導法［1］，每0.5 mg protein/mL的HDL和LDL分別與10和15 μmol/L的CuSO4于37℃、5% CO2潮濕孵箱中共同孵育24 h，然后以20倍體積的10 mmol/L PBS（pH 7.4）透析24 h以上，每8 h換液1次，以去除Cu2＋和可溶性的過氧化產物。硫代*酸反應產物熒光檢測法測定HDL氧化前后丙二醛的含量分別為0.18和8.14 nmol/mg protein, LDL氧化前后丙二醛的含量分別為2.10和14.35 nmol/mg protein。
三、試劑
DPH（1，6-二苯基-1，3，5-己三烯；1，6-dipheny-1,3,5-hexatriene）為Fluka公司產品；小鼠抗人LFA-1單克隆抗體為DAKO公司產品；FITC—羊抗鼠IgG抗體（GAM-FITC Ab）購自北京中山公司。
四、膜脂流動性的檢測［5］
用含5%小牛血清的RPMI 1640*培養基調THP-1細胞至1×106／mL，接種于24孔板中（1 mL/孔），加入終濃度為100 μg蛋白/mL的脂蛋白（HDL、oxHDL、LDL和oxLDL），對照組加入等體積的PBS，每組設2個復孔，實驗重復3次。20 h后收集細胞，用含鈣鎂的PBS液洗2次，調細胞密度為1×106/mL；另取一塑料試管，加入PBS 1 mL和20 mmol/L DPH（*配制）5 μL，充分振蕩5 min，再加入1 mL細胞懸液，輕輕搖勻，DPH終濃度為50 μmol/L，置25℃水浴30 min，PBS洗兩次，低速離心10 min，溶于1.5 mL PBS中，室溫下測熒光強度（I），激發波長360 nm，發射波長430 nm，狹縫10 nm。按下列公式計算偏振度（P）、微粘度（η）和膜脂流動性（LFU）：
P=（Ivv-gIvh）/（Ivv+gIvh）
其中g為校正因子，按下式計算：g=Ihv/Ihh；P為偏振度，I為熒光強度；v代表垂直方向，h代表水平方向，I的一對限定因素中，*個為起偏器光軸的方向，第二個為檢偏器光軸的方向。
η=2P/（0.46-P）
式中的η為微粘度，0.46為常數。
LFU=［（Pzui大值/Pr）-1］÷Pr
式中LFU為膜脂流動性，Pzui大值為0.5，Pr為P的實測值。
五、LFA-1表達的檢測
THP-1細胞以含10%小牛血清的RPMI 1640*培養基調至1×106/mL，接種于24孔板中（1 mL/孔），分為對照組（加入等體積的PBS）、HDL組和oxHDL組，脂蛋白作用時間為24 h，實驗重復4次。采用流式細胞術間接免疫熒光法檢測LFA-1的表達，主要步驟如下：取5×105細胞，用冷PBA（10 mmol/L PBS，含0.1%BSA，0.1%NaN3，pH7.4）清洗兩遍，棄上清，加入以PBA 1∶100稀釋的單克隆抗體100 μL（背景對照組只加不含單抗的PBA），輕輕吹打混勻，4℃放置30 min，PBA洗2次，再加入以1∶15稀釋的GAM-FITC Ab 100 μL，輕輕吹打混勻，4℃ 30 min，離心棄上清，用冷PBA洗3次，zui后用0.5 mL PBS懸起細胞，用FACStar-PLUS流式細胞儀檢測，以背景對照為基礎計算陽性細胞率（%）和平均熒光強度（MFI）。
五、統計處理
數據均以均數±標準差（ ±s）表示，差異顯著性以t檢驗判定。
結 果
一、oxHDL和oxLDL對THP-1細胞膜脂流動性的影響
oxHDL和oxLDL可明顯降低THP-1細胞的膜脂流動性（LFU），100 μg protein/mL的oxHDL和oxLDL作用20 h后THP-1細胞的LFU分別較對照組低45%和52%（P＜0.01）；而HDL和LDL對膜脂流動性無明顯影響（見表1）。
表1 HDLs和LDLs對THP-1細胞膜脂流動性的影響
Tab 1 Effexts of HDLs and LDLs on membrane lipid fluidity of THP-1 cells （ ±s,n=6）
| | Control | HDL | oxHDL | LDL | oxLDL |
| P | 0.145±0.021 | 0.155±0.019 | 0.180±0.009*＃ | 0.151±0.029 | 0.191±0.010* *＃＃ |
| η | 0.928±0.188 | 1.012±0.176 | 1.287±0.045*＃ | 0.992±0.285 | 1.433±0.121* *＃＃ |
| LFU | 17.970±6.140 | 15.170±4.940 | 9.930±0.690*＃ | 16.920±6.470 | 8.570±0.820*＃ |
*P＜0.05, * * P＜0.01， vs control group; ＃ P＜0.05, ＃＃ P＜0.01， vs unmodified group of each 二、oxHDL對THP-1細胞LFA-1表達的影響
oxHDL可明顯促進THP-1細胞LFA-1的表達， 100 μg protein/mL的oxHDL作用24 h后其LFA-1的陽性細胞率和平均熒光強度分別較對照組高39%和45%（P＜0.01）；而HDL無此作用（見表2）。
表2 HDLs對THP-1細胞LFA-1表達的陽性細胞率
和平均熒光強度的影響
Tab 2 Positive rate and MFI of LFA-1 on THP-1 cells in
response to HDLs （ ±s,n=4）
| | Control | HDL | oxHDL | |
| % | 43.3±3.7 | 45.2±4.5 | 60.1±2.5* *＃＃ | |
| MFI | 132.8±18.7 | 138.3±20.5 | 191.5±17.6* *＃＃ | |
* *P＜0.01，vs control group; ＃＃ P＜0.01， vs HDL group; mFI: mean fluoresence intensity討 論
THP-1細胞是一種人單核細胞株，建株于一急性單核細胞白血病患兒，具備人單核細胞絕大多數的生物學功能和生化功能特征。與人單核細胞相比，THP-1細胞更容易獲得、并能傳代培養，經佛波酯刺激后可轉變為巨噬細胞，吞噬脂質后可進一步演變成泡沫細胞，因此被廣泛用于有關動脈粥樣硬化方面的研究［6］。
本研究進一步探討了oxHDL對動脈粥樣硬化發生中的重要細胞成分—單核細胞—的作用。結果發現，oxHDL和oxLDL可降低THP-1細胞的膜脂流動性（LFU），與對照組相比分別低45%和53%，而HDL和LDL對膜脂流動性無明顯影響。已有研究表明，oxLDL可降低內皮細胞膜脂流動性，其機制可能為：①氧化脂蛋白可被細胞膜上的受體攝取，從而使細胞膜中膽固醇酯的含量增加；②氧化脂蛋白導致的細胞內鈣濃度增加，可使膜收縮蛋白發生交聯［7，8］。氧化脂蛋白使單核細胞膜脂流動性的降低，將使單核細胞在進入內膜后更難于返回循環血中，從而使更多的單核細胞向巨噬細胞和泡沫細胞轉化。
LFA-1主要位于白細胞的表面，是細胞間粘附分子ICAM-1和ICAM-2的受體，在單核細胞與內皮細胞的粘附中發揮重要作用。本研究表明oxHDL可明顯促進THP-1細胞LFA-1的表達，流式細胞儀檢測顯示oxHDL作用24 h后其陽性細胞率和平均熒光強度分別較對照組高39%和45%，而HDL無此作用。
本研究表明，oxHDL可通過促進單核細胞表達LFA-1而使更多的單核細胞粘附于內皮，它還可降低單核細胞膜脂流動性，這將使單核細胞在進入內皮下層后難于重新返回循環血中，從而促進動脈粥樣硬化的發生。本研究還提示，通過防止各種因素對脂蛋白的氧化將會在一定程度上預防動脈粥樣硬化的發生。關于oxHDL的體內存在形式以及是否具有更廣泛的致動脈粥樣硬化作用尚有待進一步研究。
相關產品
免責聲明
- 凡本網注明“來源：化工儀器網”的所有作品，均為浙江興旺寶明通網絡有限公司-化工儀器網合法擁有版權或有權使用的作品，未經本網授權不得轉載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經本網授權使用作品的，應在授權范圍內使用，并注明“來源：化工儀器網”。違反上述聲明者，本網將追究其相關法律責任。
- 本網轉載并注明自其他來源（非化工儀器網）的作品，目的在于傳遞更多信息，并不代表本網贊同其觀點和對其真實性負責，不承擔此類作品侵權行為的直接責任及連帶責任。其他媒體、網站或個人從本網轉載時，必須保留本網注明的作品第一來源，并自負版權等法律責任。
- 如涉及作品內容、版權等問題，請在作品發表之日起一周內與本網聯系，否則視為放棄相關權利。
采購中心