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成像基礎知識入門，如何選擇適合自己的成像方法！
生命科學領域中的成像常用于觀察對象形態和結構、分布和定位以及動力學和相互作用，根據使用的顯微鏡、觀察對象和樣品類型選擇不同的成像方法。FUFJIFILM Wako提供適用于新型成像技術如組織透明化和光電關聯顯微鏡（CLEM）的各類試劑，以及成像常用的發光/熒光探針。
◆成像所需的設備和試劑
顯微鏡
顯微鏡可以通過放大觀察到肉眼無法看到的微小樣品。然而組織和細胞的組成成分對光的透過性接近，由于對比度較低，難以識別其形態和結構。因此當使用常規光學顯微鏡進行觀察時，需通過染色或光學處理增加對比度。此外還有其他多種類型的顯微鏡包括熒光顯微鏡和電子顯微鏡等（表1）。
表1：常見顯微鏡的特征和用途
顯微鏡類型 | 特點 | 用途 |
明視野顯微鏡 | 常用的光學顯微鏡，光源照亮整個視野，通過染色增強對比度。 | 觀察染色樣品 |
暗視野顯微鏡 | 從樣品的側面打光，并觀察散射光。 | 觀察非染色樣品 |
相差顯微鏡 | 將樣品折射率差異產生的衍射光和直射光的相位差，轉換為明暗特征， 觀察由此產生的對比度。 | 觀察無色透明試劑 |
微分干涉顯微鏡 | 將樣品內光路長度（折射率×厚度）的梯度轉換為明暗特征，觀察由此 產生的對比度。 | 觀察無色透明試劑 |
熒光顯微鏡 | 將激發光照射到樣品中的熒光物質上，對發出的熒光進行處理后形成 圖像。 | 觀察使用熒光染料標記的胞 和組織 |
共聚焦顯微鏡 | 通過使用點光源和針孔將光線聚焦到樣品內部，可非侵入性地獲取切片 的高分辨率圖像。 | 細胞和組織的三維觀察 （通常使用熒光染料標記） |
掃描顯微鏡 | 使用電子束掃描樣品，觀察從二次電子和反向散射電子中獲得的圖像。 | 觀察樣品表面的微結構 |
透射電子顯微鏡 | 使用電子束照射樣品，觀察從透射電子獲得的圖像 | 觀察樣品內部的微結構 |
聚焦-光電關聯顯微鏡法（CLEM）用試劑- 光電關聯顯微鏡法（CLEM）是使用光學顯微鏡和電子顯微鏡 觀察同一樣品，并比較其圖像來分析細胞內細胞和細胞分子定 位和形態的方法。 由于熒光染料會褪色，通過傳統方法難以對同一切片使用光學 顯微鏡和電子顯微鏡觀察，但使用FUJIFILM Wako的熒光恢 復試劑可對同一切片進行反復觀察。 |
圖1：CLEM法中電子顯微鏡和熒光顯微鏡的重疊圖像 |
前處理試劑
使用顯微鏡觀察組織和細胞時，需要固定和維持樣本的原始狀態。通常使用福爾馬林等交聯生物分子固定樣本，同時防止分解和腐敗。當使用抗體進行蛋白質檢測時，需使用可滲透細胞膜的表面活性劑（TritonX-100）或有機溶劑進行處理。此外根據實驗情況，可能還需要去除或封閉不必要的染料或探針，以防止抗體的非特異性結合。
聚焦-透明化試劑- 生物組織中含有各種不同折射率的物質，它們會導致光散 射。因此生物組織透明化時，需要去除組織中高折射率的 成分，或用高折射率液體替代溶液，或同時采取兩種措 施，從而使組織折射率統一化。 通過組織透明化，可實現深部組織成像和高分辨率觀察。 |
圖2：透明化試劑處理的小鼠大腦 （左：未處理，右：處理后） |
探針
觀察特定的細胞、分子和生命現象時需根據觀察對象選擇特異性探針，以下將介紹成像常用的發光/熒光探針。
發光探針
發光探針被化學反應激發，并在其恢復到基態時發光。發光依賴于化學反應，因此該技術具有高選擇性、低噪聲，并產生強信號。由于其動態范圍寬，常用于分析ATP和鈣離子的動力學。典型的發光探針有熒光素-熒光素酶 (FLuc)、脫輔基水母發光蛋白和海腎熒光素酶 (RLuc)-腔腸素。
熒光探針
熒光探針首先被光激發，并在其恢復到基態時重新發射光。與發光探針相比，熒光探針的優勢在于無需反應底物，只需使用激發光即可獲得信號。熒光探針的缺點則在于生物體中除熒光探針以外還存在其他熒光物質，因此與發光探針相比，它的噪聲高且動態范圍窄。
常用的熒光探針包括羅丹明和熒光素等有機熒光染料，以及GFP等熒光蛋白。FUJIFILM Wako可提供各種專用于標記細胞和細胞器，以及功能分析用的探針（表2）。
表2：針對不同觀察對象的熒光探針
觀察對象 | 目標和熒光探針 |
細胞形態和運動 | 細胞骨架（肌動蛋白絲、微管、中間絲） |
特定的細胞和 細胞器 | 細胞核 可將染料注射到神經元內標記神經元和神經回路。注入細胞內用于標記神經末梢的染料稱為“順向 示蹤劑”，而注入神經末梢用于標記細胞的染料則稱為“逆向示蹤劑“，如羰花青染料和葡聚糖金。 |
定位生物分子 | 核酸 使用目標蛋白質特異性抗體，一抗直接與熒光團結合，或使用熒光染料標記的二抗檢測。如無合適的 抗體，目標蛋白可通過親和標簽或熒光蛋白進行標記并表達。 多糖 |
細胞內活動 | 細胞內信號轉導 使用熒光強度隨鈣濃度變化的鈣敏感探針觀察與鈣相關的細胞內信號轉導，鈣探針包括水母發光蛋 白、Indo1、Fluo4 和 Fura2。 pH值變化 pH敏感探針的熒光強度與pH值變化相關，使用pH敏感探針可檢測自噬過程中溶酶體融合和內容物 降解典型的pH敏感熒光探針有BCECF和SNARF-1。 |
相互作用 | 蛋白質相互作用 兩種蛋白的相互作用基于熒光共振能量轉移（FRET）原理，使用不同的熒光染料（如CFP和YFP）分 別標記兩種蛋白質，當兩者靠近時，其中的一種熒光會激發另一種。 |
1. GFP and Bioimaging”ed. by Miyawaki, A., Yodosha, Japan, (2000). (日文)
2. "How to select and use fluorescent and luminescent reagents for successful experiments”ed. by Miwa, Y., Yodosha, Japan, (2007). (日文)
3. "Handbook for Staining and Bioimaging Experiments 5th ed.” ed. by Takata, K., Saito, N. and Kawakami, H., Yodosha, Japan, (2012). (日文)
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