穩定同位素是指質子數相同而中子數不同、且原子核結構穩定、不發生自發放射性衰變的同一元素的不同原子形式，例如氘（2H）、碳-13（13C）、氮-15（1?N）和氧-18（1?O）等。目前自然界中已發現274種穩定同位素，它們因質量差異在物理、化學及生物過程中產生同位素分餾效應，從而成為表征物質遷移與轉化路徑的天然示蹤劑，被廣泛應用于多個科研與工業領域。

在藥物研發中，穩定同位素標記化合物發揮著關鍵作用。制藥企業及生物技術公司將其應用于藥代動力學（DMPK）研究、制劑開發與安全性評價，通過同位素標記實現藥物及其代謝產物在生物體內的精準定性、定量追蹤。合同研究組織（CRO）則借助此類標記物實現跨實驗室數據可比性與一致性，提升研究結果的可靠性與重現性。此外，高等院校與科研機構也利用穩定同位素標記技術揭示生物代謝通路和環境系統中物質的動態行為。

在分析檢測中，穩定同位素內標對于提高定量分析的準確度和精密度至關重要，電噴霧質譜法尤其如此。本文介紹了選擇與使用同位素內標時的關鍵因素，比如同位素純度、同位素標記位點、內標與分析物之間的分子量差異、以及內標和分析物之間的摩爾對等性等。

Section.01

如何選擇合適的穩定同位素內標

有很多不同品牌的供應商可提供內標產品。絕大多數都是基于以下取代：2H(氘)取代氫原子，13C取代碳原子或是15N取代氮原子。13C和12C或是15N和15N之間的相對分子量差異遠小于2H和1H之間的相對分子量差異，這使得13C和15N的使用更為普遍，因為同位素效應被盡可能地減少了。如果使用氘，則應將實現高質量分辨率所需要的2H同位素標記物的數量保持在最小值。

在選擇合適的內標時，需重點考慮以下四個因素。

1）內標合成過程中，由于前體的同位素標記不完-全，會導致未標記分子殘留而造成污染。理想情況下，未標記分子比例應< 2%，以避免復雜的修正計算。

2）分析物與其同位素之間的最-優分子量偏差。選擇具備足夠分子量偏差的同位素內標，這樣可以避免跟分析物分子中天然存在的穩定同位素造成的M+1, M+2, M+3等分析物譜線重疊(比如，30%天然比例的37Cl vs 35Cl，或是1%天然比例13C vs 12C)。對于分子量較小的有機分子(例如，50-800個質量單位)的通用原則是：同位素內標與分析物之間應該存在至少3個質量單位的差別，對于存在多個氯原子的分子應有更大的分子量偏差(這些分子在M+2和M+4處具備非常高的天然同位素比例)。但是，如果分析物和同位素內標之間總的相對分子量偏差太大，則“同位素效應”(內能不同所導致的)會導致出現層析分離。

3）很多情況下，根據所選條件的不同，對于具體的測試方法，標記位點應在碎片化之后的待測片段上（參見圖1和圖2）。

圖1：正確的氘標記位置示例

圖2：錯誤的氘標記位置示例

4）提取方法應具備很好的穩定性。例如，避免2H標記物位點緊鄰羰基基團，因為羰基基團在某些條件下容易出現氫-氘置換。由于其在分子結構中更加穩定，13C 和15N的同位素標記物應用比2H更多。 18O同位素標記物很少使用，這是因為氧原子在分子內部通常處在不穩定的位置上。

Section.02

如何規范使用穩定同位素內標

與所有常規的內標一樣，在檢測開始前（提取前）將穩定同位素內標加入樣品中并使其在樣本中實現平衡。如果未做到這一點，則與分析物相比，內標提取效率出現差異的風險會增加。

樣品中所加入的穩定同位素內標的濃度必須跟分析物校正范圍近似。如果同位素內標與分析物之間的摩爾比例出現很大的偏差，則分析物中天然比例相對較小的穩定同位素（或是穩定同位素內標中殘留的非同位素分析物）會變得比較突出，從而使校正不再是線性的。

穩定同位素內標與其類似的分析物是一一對應的。因此，對于多分析物電噴霧LC-MS方法而言，每一種分析物的定量都需要一種對應的穩定同位素內標。例如，在混配的類固醇標準物質中，采用睪酮-d3確定其他雄激素的比例時所存在的風險要高于完-全不采用內標。

Section.03

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