在免疫組織化學（IHC）實驗中，科研人可能會把主要精力投入到抗體選擇、抗原修復和顯色系統優化上，而忽略一個關鍵的操作步驟：固定。固定并不僅僅是“把組織泡起來”的簡單操作，而是需要精心設計、嚴格把控的實驗藝術。固定需要在分子層面“凍結”生命活動的瞬間，保持細胞形態的完整性，并保留抗原的免疫反應性。

蛋白質的物理、化學性質迥異，對應的固定方法和固定液的反應也不盡相同。

「IHC診斷室」第7期，將系統梳理IHC常用固定液配方及其配制步驟，為實驗者提供一份可信賴的技術參考。

一、甲醛類固定液：經典中的經典

10%中性緩沖福爾馬林（NBF）和4%多聚甲醛（PFA）依然是當今IHC實驗中應用廣泛的固定液。其固定機制在于與蛋白質中的氨基、羥基等基團形成交聯，穩定組織結構。

10%中性緩沖福爾馬林配制較簡單，常規配方如下：

4%多聚甲醛（PFA）根據實驗目的和使用場景不同，有兩種配制方法。

溶液一的配制步驟：

(1) 稱取40 g多聚甲醛粉末，置于三角燒瓶中。

(2) 加入500-800 mL 0.1 M磷酸緩沖液（PB）。

(3) 加熱至60℃左右，持續攪拌（或磁力攪拌）使粉末溶解，通常需滴加少許1N NaOH才能使溶液清亮。

(4) 補足0.1 M磷酸緩沖液至1000 mL，充分混勻。

此固定液較適用于IHC研究，特別是動物灌注固定取材及后續的浸泡固定（2-24 h）。固定液較為溫和，適合組織標本的長期保存。

溶液二的配制步驟：

(1) A液在500 mL的三角燒瓶中配制，加熱至60℃左右溶解。至多聚甲醛溶解后冷卻備用。

(2) 配制B液和C液。

(3) 將B液倒入C液中，混合后再加入A液。

(4) 用1N NaOH或HCl將pH值調至7.2-7.4。

(5) 加ddH₂O定容至1000 mL，4℃冰箱保存備用。

此固定液適用于光鏡和電鏡免疫組織或細胞化學研究。用于免疫電鏡檢測時，建議加入少量新鮮配制的戊二醛（終濃度為0.5-1%）。戊二醛屬于雙醛類固定劑，交聯能力比甲醛強，有利于保存超微結構，但對抗原性的損傷也較大。在IHC實驗中，戊二醛與甲醛聯合使用，能夠滿足結構保存和抗原保留平衡的需求。

二、傳統固定液的改良與創新

2.1 Bouin's液及其改良配方

Bouin's液是組織學和病理學的傳統固定劑，由bitter acids、甲醛和冰醋酸組成。bitter acids沉淀蛋白引起組織收縮，但不會使組織硬化。Bouin's液對組織穿透力較強，固定效果好，對細胞的微細結構顯示清晰，適用于富含結締組織、胚胎及植物組織的標本，尤其在Masson三色法中，經其固定后組織著色鮮艷。

Bouin's液常規配方為飽和bitter acids750 mL、40%甲醛250 mL、冰醋酸50 mL，混合后移至棕色瓶中，存于4℃冰箱。冰醋酸臨用前加入。改良版Bouin's液不加冰醋酸。

Bouin's液常規固定時間為12-24小時。由于該固定液呈酸性（pH 3-3.5），對抗原可能有一定損害，在固定1-2天后需換入4%的甲醛溶液中保存。

目前常用市售飽和bitter acids溶液直接配制。如果你手上是bitter acids粉末，則需要一種“邪修”方案了。首先在燒杯中加入1000 mL蒸餾水，并不斷加入bitter acids粉末，邊加邊攪拌，直至有少量bitter acids結晶出現為止。靜置并過濾。然后取750 mLbitter acids溶液與250 mL 40%甲醛混勻。最后加入冰醋酸。

2.2 Zamboni's液配方及其配制

Zamboni's固定液對超微結構的保存效果好于甲醛，可用于電鏡和顯微鏡IHC檢測。實驗室常用配方為2.5%的多聚甲醛和30%的飽和bitter acids，固定時間控制在6-18小時。

2.3 PFG固定液的配制

PFG固定液由對苯醌、多聚甲醛和戊二醛構成，結合了甲醛快速滲透和戊二醛的強效蛋白交聯能力，又不影響超微結構的保存，適用于電鏡樣本的制備或對結果穩定性要求高的IHC實驗。

2.4 Karnovsky's固定液配制

適用于電鏡免疫化學檢測，在4℃短時固定效果好。推薦的操作流程為：進行灌注固定，隨后浸泡固定10-30分鐘。“短時冷固定”策略已成為保存超微結構和肽類抗原的常用方法。

讀到這里，你是否發現IHC固定液的世界遠比“倒點甲醛泡一泡”要精彩的多，甲醛的“好搭子”遠超想象。不同的組合、不同的配比，將會在組織或細胞結構中呈現不一樣的結果。掌握這些固定液的配制方法，將會獲得一張特異性強、背景干凈的精美片子。