背景：

絲狀真菌引起的侵襲性感染是免疫功能低下患者發病和死亡的主要原因?？焖佟蚀_地鑒定絲狀真菌對于及時啟動合適的抗真菌治療至關重要。傳統的鑒定方法（基于形態學）耗時且依賴專家經驗，而分子技術（如測序）成本高、速度慢，限制了其在常規診斷中的應用。基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）已成為細菌和酵母菌快速鑒定的有效工具，并逐漸應用于絲狀真菌的鑒定。然而，其鑒定成功率受數據庫覆蓋度和樣本制備方法的影響。

目的

? 評估并比較制造商推薦的三種不同樣本制備方法（改良直涂法、提取法、液體培養法）對230株絲狀真菌分離株在屬和種水平上的鑒定率影響。

? 驗證一個內部設定的、更低的種水平鑒定閾值（logscore ≥1.70）是否能在不增加錯誤鑒定的前提下，提高種水平的正確鑒定率。

實驗方法

? 研究對象：230株絲狀真菌分離株（185株臨床分離株 + 45株參考菌株），均通過傳統形態學方法（部分輔以ITS2區域測序）進行鑒定。

? MALDI-TOF MS平臺：使用商業微生物質譜系統及其商業化的絲狀真菌數據庫。

? 樣本制備：對每株分離株分別采用三種方法：

改良直涂法 (Extended direct transfer)：簡單快速的方法。5分鐘

提取法 (Extraction)：通過乙醇/甲酸處理提取蛋白質，步驟更復雜。15分鐘

液體培養法 ：先在液體培養基中培養，再進行提取，最為耗時。24小時

結果判讀：

? 制造商標準：logscore ≥2.0為高可信度（種水平），1.70-1.99為低可信度（屬水平），<1.70為無法鑒定。

? 內部標準：將種水平鑒定的閾值降低至 logscore ≥1.70。

? 驗證：將MALDI-TOF MS的鑒定結果與傳統方法（金標準）的結果進行比對，評估正確率和錯誤率。

實驗結果

? 樣本制備方法的影響：

更復雜的樣本制備方法顯著提高了種水平的鑒定率。改良直涂法：種水平鑒定率為48.9%。提取法：種水平鑒定率提升至 62.0%。液體培養法：種水平鑒定率達到最高的 76.1%。在所有情況下，均未發生錯誤鑒定（即沒有將A菌鑒定為B菌）。

圖1.使用三種不同樣本提取方法對菌種進行 MALDI-TOF  MS 結果分析（部分）

? 內部閾值（≥1.70）的效果：

應用更低的閾值后，種水平的正確鑒定率進一步大幅提升。使用液體培養法結合內部閾值，種水平鑒定率最高可達 86.4%。

         圖2.三類提取方法鑒定成功率比對

大微實驗室驗證：

依據文獻中的技術路線，本實驗室采用DW-MS 5500系統對黑曲霉Aspergillus niger進行改良直涂法和提取法分別進行處理，從譜圖和系統評分可直觀判斷兩種方法的鑒定表現；改良直涂法并不能很好的將黑曲霉胞內的蛋白提取出，從而導致特征峰無法被儀器收集，評分低于<1.70判定為鑒定失敗；而提取法使得胞內容物更多被析出，鑒定結果置信度高且特征峰明顯。

圖3.改良直涂法鑒定譜圖（大微實驗室測試結果）

圖4.提取法鑒定譜圖（大微實驗室測試結果）

實驗結論 

? MALDI-TOF MS平臺適用性：結合商業數據庫和標準化的樣本制備流程，MALDI-TOF MS能夠實現對絲狀真菌的高準確率鑒定，適用于常規實驗室檢測。

? 樣本制備策略：遵循制造商推薦的分步策略（先用改良直涂法，如鑒定失敗后再用提取法）進行樣本制備是有效的，因為操作上更復雜的制備方法（提取法）能顯著提高絲狀真菌的鑒定成功率。

? 內部閾值驗證：將絲狀真菌的種水平鑒定閾值從≥2.0降低至≥1.70是安全且有效的。該策略能顯著提高種水平的鑒定率，同時幾乎不引入錯誤鑒定（僅一例可解釋的輕微錯誤）。因此，該內部閾值可以在常規實驗室檢測中被采納和應用。