實驗概要：

子宮平滑肌細胞的收縮功能與胞內鈣離子信號動態變化高度耦合，鈣離子瞬變既是啟動宮縮的核心分子事件，也是評價子宮興奮性、炎癥損傷及藥物效應的關鍵指標。隨著細胞功能研究向高時空分辨、實時動態、可視化方向發展，鈣成像技術已成為細胞信號研究的核心支撐手段，它能夠在活細胞狀態下實時捕捉胞內Ca²⁺濃度的瞬時變化，精準反映細胞興奮-收縮耦聯全過程，具有非侵入、動態連續、單細胞分辨率等突出優勢，是目前解析平滑肌收縮機制、炎癥通路激活與藥物作用靶點zui kekao的光學檢測技術。

為充分發揮鈣成像系統在生殖醫學與圍產領域的應用潛力，本技術分享以C57小鼠子宮平滑肌細胞為研究模型，建立原代細胞分離-純化培養-鈣信號標測一體化實驗方案，將鈣成像技術拓展應用于子宮收縮功能評價。依托高靈敏度鈣成像設備，可實時記錄生理性宮縮、炎癥誘導早產及硫酸鎂抑制宮縮等不同模型下的鈣瞬變特征，清晰呈現催產素（OT）觸發鈣信號、脂多糖（LPS）增強鈣響應、硫酸鎂阻斷鈣內流與鈣庫釋放的動態過程，實現從細胞水平對宮縮調控機制的可視化、定量化研究。

本方案不僅wanshan了鈣成像技術在生殖領域的應用場景，更充分展現了鈣成像設備高分辨率、高穩定性、多通道并行給藥、長時間動態監測的核心優勢，可為早產機制研究、保胎藥物篩選、藥效評價與機制驗證提供高效、可靠、可重復的實驗平臺，推動鈣成像技術從基礎研究向臨床轉化應用進一步拓展。

實驗目的：

建立C57小鼠原代子宮平滑肌細胞分離培養與鈣成像檢測體系，利用鈣成像設備模擬并記錄生理性宮縮、炎癥性早產及藥物抑制宮縮的細胞鈣瞬變信號，為子宮功能研究與疾病模型藥物評價提供標準化方法。

實驗動物：

雌性C57小鼠

實驗方法：

采用酶消化法分離培養C57小鼠原代子宮平滑肌細胞，經熒光染料負載后，使用鈣成像設備檢測不同處理組的細胞鈣瞬變動態過程。

實驗原理：

子宮平滑肌收縮依賴胞內Ca2+瞬時升高，Fluo-4 AM 熒光指示劑可實時反映胞內Ca2+濃度變化，通過OT、LPS、MgSO4分別構建宮縮、炎癥早產、藥物抑制模型，由鈣成像系統實現鈣信號可視化與定量檢測。

Protocol（C57小鼠子宮平滑肌細胞鈣成像標測實驗案例）

一、實驗前準備

（一）主要試劑：

I型膠原酶、0.25%含EDTA胰酶、HBSS緩沖液、SMCM培養基、FBS、雙抗（PS）、SMCGS、Fluo-4 AM、催產素（OT）、脂多糖（LPS）、硫酸鎂（MgSO4）等。

（二）主要器材：

手術剪，顯微剪，顯微鑷，平鑷，滅菌盒（器械需提前進行高壓滅菌）。

（三）主要溶液配方：

1.灌流液配制（500 mL）

2.組織消化酶：

（1）100 mg/mL（100x）母液：100 mg I型膠原酶＋1 mL HBSS；

（2）0.22 μm濾膜過濾；

（3）10 mL 0.25%含EDTA胰酶中加入256 μL I型膠原酶母液。

3.基礎培養基：SMCM

wanquan培養基：SMCM+2% FBS+1% PS＋1% SMCGS

4.藥品配制

（1）催產素OT母液：購買10 mM母液，取1 μL母液加入10 mL灌流液中

（2）脂多糖LPS母液：5 mg LPS溶于1 mL超純水中

（3）硫酸鎂MgSO4母液：1 mg硫酸鎂溶于1mL純水中

二、子宮平滑肌細胞分離與培養

1. 高壓滅菌手術器械與耗材，超凈臺紫外照射30 min，提前預熱培養基與消化液。

2. 小鼠經麻醉處死后，wanquan浸入75%酒精中消毒5 min，無菌條件下打開腹腔，分離雙側子宮，剔除脂肪、卵巢及結締組織，轉入 HBSS中沖洗2–3 次。

3. 在解剖顯微鏡下，用顯微鑷固定子宮，顯微剪仔細剔除漿膜外膜組織，降低成纖維細胞污染。

4. 將處理干凈的子宮組織移入含消化液的培養皿，用眼科剪充分剪碎，置于37 ℃恒溫搖床，100 rpm避光消化4–6 h。

5. 消化結束后加入2 mL wanquan培養基終止消化，用移液槍連續輕柔吹打10–15 次，使細胞充分分散。

6. 細胞懸液依次經100 μm 細胞篩過濾，再經40 μm 細胞篩過濾，濾液收集至50 mL 離心管。

7. 1000 rpm離心10 min，棄上清；加入SMCM培養基重懸細胞，1000 rpm離心10 min，棄上清，重復離心洗滌2 次，充分去除組織碎片與死細胞。

8. 用wanquan培養基重懸細胞沉淀，接種于包被的培養皿/細胞爬片，置于37 ℃、5% CO2培養箱培養，3–5 天形成梭形、束狀排列的單層平滑肌細胞。

培養4天的原代子宮平滑肌細胞

三、鈣成像檢測

1. 取培養至單層融合的子宮平滑肌細胞爬片，棄培養基，用預熱灌流液輕輕漂洗1 次。

2. 加入適量Fluo-4 AM 染色工作液，37 ℃避光孵育30 min，取出后室溫避光繼續孵育20 min。

3. 用預熱有鈣灌流液輕輕漂洗細胞1–2 次，去除未負載的游離染料。

4. 將細胞爬片固定置于鈣成像系統浴槽中，開啟灌流系統與恒溫裝置，維持浴槽溫度37 ℃，基線灌流平衡5 min。

5. 按分組依次通過八通道灌流系統進行灌流、細胞旁快速給藥，全程連續記錄熒光信號：

●Tube1：灌流1 μM OT，記錄生理性宮縮鈣信號；

●Tube2：灌流1 μM OT+20 μg/mL LPS，記錄炎癥性早產鈣信號；

●Tube3：灌流1 μM OT+20 μg/mL LPS+ 500 μg/mL MgSO4，記錄藥物抑制炎癥性早產鈣信號。

四、數據采集與記錄

1. 1 μM OT 模擬生理性宮縮

軟件分析界面

鈣瞬變信號熒光強度變化視頻

2. 1 μM OT+20 μg/mL LPS 模擬炎癥性早產

軟件分析界面

鈣瞬變信號熒光強度變化視頻

3. 1 μM OT+20 μg/mL LPS+500 μg/mL MgSO4 模擬藥物抑制宮縮

軟件分析界面

鈣瞬變信號熒光強度變化視頻

●OT組：鈣熒光強度快速升高，呈現規律鈣瞬變，代表正常宮縮。

●OT+LPS組：鈣信號幅度與頻率顯著增強，提示炎癥介導異常宮縮。

●OT+LPS+MgSO4組：鈣信號明顯被抑制，幅度降低，MgSO4緩解LPS和OT引起的過量鈣釋放。

五、注意事項

1. 必須在解剖鏡下che di剔除外膜，顯著降低成纖維細胞污染。

2. 推薦使用平滑肌專用培養基或含 20% FBS 的 DMEM/F-12，維持細胞形態與收縮功能。

3. 鈣成像全程避光操作，嚴格控制染料孵育時間，避免熒光淬滅。

4. 灌流液pH、溫度、鈣濃度保持穩定，保證信號重復性與設備檢測精度。

5. 消化時間根據組織狀態微調，過度消化會降低細胞活率與鈣信號質量。

參考文獻

[1]Han H ,Ying X ,Chen Q , et al.Monitoring of inflammatory preterm responses via myometrial cell based multimodal electrophysiological and optical biosensing platform[J].Biosensors and Bioelectronics,2025,274117197-117197.DOI:10.1016/J.BIOS.2025.117197.