牙髓干細(xì)胞（DPSCs）分泌血管生成因子，如 VEGF，以促進 EC 增殖和遷移，啟動新血管形成，并逐步作為周細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)支持并穩(wěn)定新生血管。然而，參與微調(diào)新生血管芽和血管穩(wěn)定的各種促血管生成和抗血管生成的因素尚未wanquan理解。以往研究表明，與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的直接接觸培養(yǎng)會推動 DPSC 向平滑肌細(xì)胞（SMCs）的分化，在此過程中，轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）的上調(diào)至關(guān)重要。有趣的是，屬于 TGF-β 超家族的激活素A（Activin A）在 DPSC-HUVEC 共培養(yǎng)中也顯著增加，并在第6天達(dá)到峰值。然而，其在 DPSC-HUVEC 共培養(yǎng)過程中調(diào)控血管生成的作用仍然難以確定。

Activin A 是一種多功能細(xì)胞因子，參與多種生物過程，包括胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖與分化、免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)以及傷口愈合。Activin A 通過上調(diào)其血管內(nèi)皮生長因子受體1（VEGFR1）來抑制 HUVEC 增殖和血管生成，該受體是 VEGF 的誘餌受體，從而減少 VEGFR2 的活化及隨后的 EC 血管形成。由于 DPSCs 與 HUVECs 的直接相互作用重現(xiàn)血管生成過程并誘導(dǎo) Activin A 的分泌，有理由假設(shè) Activin A 可能參與 DPSC-HUVEC 共培養(yǎng)中成熟且穩(wěn)定的微血管網(wǎng)絡(luò)形成。

基于此，香港大學(xué)牙醫(yī)學(xué)院修復(fù)牙科學(xué)聯(lián)合廣州市口腔再生醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點實驗室團隊在一項研究中利用體外 DPSC-HUVEC 共培養(yǎng)模型，探討了 Activin A 表達(dá)的動態(tài)模式及其在調(diào)控細(xì)胞功能中的作用。研究證明 DPSC-HUVEC 共培養(yǎng)顯著促進 Activin A 的分泌，Activin A 未影響 DPSC 向 SMCs 的分化，但破壞 HUVECs 中 VEGF 受體的平衡，抑制 HUVEC 新生血管芽并增強血管穩(wěn)定。這些發(fā)現(xiàn)揭示了在血管形成和穩(wěn)定過程中，HUVECs 與 DPSCs、Activin A 和 VEGFR1/2 之間的關(guān)鍵旁分泌串?dāng)_，這可能成為加速牙髓血管形成和再生的分子靶點。研究成果發(fā)表于 The International Endodontic Journal 期刊題為“Activin a regulates vascular formation and stabilization in direct coculture of dental pulp stem cells and endothelial cells”。

首先，ELISA 表明，DPSCs 和 HUVECs 的直接共培養(yǎng)中 Activin A 分泌顯著增加，而在 DPSCs 或 HUVECs 單培養(yǎng)中水平極低（圖1 a）。與單培養(yǎng)相比，D+E 共培養(yǎng)中激活素結(jié)合蛋白——卵泡抑素（Follistatin）的分泌下調(diào)且基因表達(dá)降低，INHBA 基因表達(dá)上調(diào)（圖1 b-d）。VEGF 的分泌模式與 Activin A 相反。在早期和晚期，D+E 共培養(yǎng)的 VEGF 濃度顯著低于 DPSC 單一培養(yǎng)，甚至無法檢測到（圖1 e）。相比之下，D+E 共培養(yǎng)中的 VEGF 基因表達(dá)在共培養(yǎng)后第1天和第6天保持升高（圖1 f）。為驗證 DPSCs 與 HUVECs 直接共培養(yǎng)對 Activin A 分泌的必要性，將兩者進行間接共培養(yǎng)，結(jié)果顯示 DPSC 或 HUVEC 單培養(yǎng)與 D+E 間接共培養(yǎng)在 Activin A 分泌上無差異（圖1 g）。這些數(shù)據(jù)表明，DPSCs 和 HUVECs 的直接接觸共培養(yǎng)會誘導(dǎo) Activin A 分泌。

為評估 D+E 共培養(yǎng)中 Activin A 的分泌是否介導(dǎo) DPSC 向 SMCs 的分化，將其與 DPSCs 共處理6天。結(jié)果顯示，DPSCs 用 Activin A（25、50和100 ng/mL）處理后，盡管 RNA 水平變化輕微或無顯著變化，但未引起 SMC 特異性標(biāo)志物（α-SMA、Calponin 1和SM22α）蛋白水平的顯著變化，這說明 Activin A 不影響 DPSC 分化為 SMCs 的過程。

圖1    Activin A在牙髓干細(xì)胞（DPSC）單培養(yǎng)、人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）單培養(yǎng)和DPSC+HUVEC共培養(yǎng)中的表達(dá)和分泌。

接下來，為探討 Activin A 對血管生成反應(yīng)的影響，HUVECs 在指定時間點用 Activin A（100 ng/mL）處理。CCK-8結(jié)果顯示，與對照組相比，Activin A 顯著減少了 HUVEC 增殖，相比之下，與 VEGF 聯(lián)合處理顯著消除了抑制作用（圖2 a）。劃痕實驗評估 HUVECs 的遷移過程，發(fā)現(xiàn) Activin A 對 HUVEC 遷移具有抑制作用，相比之下，VEGF 刺激顯著增強了遷移率，而 Activin A 抑制了 VEGF 誘導(dǎo)的 HUVEC 遷移（圖2 b）。Matrigel管形成分析顯示，Activin A 抑制 HUVEC 管形成能力，與 VEGF 聯(lián)合處理可以通過增強分支數(shù)和總管長來逆轉(zhuǎn) Activin A 的作用（圖2 c）。在3D球體出芽試驗中，Activin A 預(yù)處理的 HUVEC 球體較對照組發(fā)芽長度減少約18.9%。此外，VEGF 誘發(fā)的發(fā)芽也被 Activin A 共處理顯著抑制（圖2 d）。與功能實驗檢測一致，血管生成激活標(biāo)志物 vWF 和 CD31 的 mRNA 和蛋白表達(dá)在 Activin A 處理后顯著抑制（圖2 e、f）。總體而言，Activin A 刺激降低了 HUVEC 血管生成能力，部分逆轉(zhuǎn)了 VEGF 的促血管生成效應(yīng)，表明其可能在 VEGF 介導(dǎo)的血管生成中起關(guān)鍵作用。

為了解 DPSCs 與 HUVEC 相互作用如何通過自分泌或旁分泌機制影響血管生成反應(yīng)，隨后分析了暴露于 DPSC 單培養(yǎng)或 D+E 共培養(yǎng)的 CM 中 HUVEC 功能反應(yīng)。結(jié)果顯示，培養(yǎng)3天后，D+E-CM 顯著降低了 HUVEC 增殖，且劃痕愈合速度顯著慢于對照組。為探究 Activin A 是否與 D+E-CM 對 HUVEC 增殖和遷移的抑制作用有關(guān)，將 HUVEC 暴露于添加 Activin A 中和抗體（IgG）的 D+E-CM 中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移均增加，也增強了 HUVEC 管形成的能力，同時抵消了 HUVEC 暴露于 D+E-CM 導(dǎo)致的發(fā)芽長度顯著減少這一效應(yīng)。血管生成標(biāo)志物的表達(dá)與這些功能結(jié)果一致，D+E-CM 對 vWF 和 CD31 表達(dá)的抑制作用在 Activin A 中和后被部分逆轉(zhuǎn)。

圖2     在用Activin A處理后，HUVECs的血管生成功能。

共培養(yǎng)中編碼 VEGFR1 的 FLT-1（FMS樣酪氨酸激酶1）基因的表達(dá)在第6天進行了評估（圖3 a），發(fā)現(xiàn)在 D+E 共培養(yǎng)中，可溶性（s）和膜結(jié)合型（m）形式的 FLT-1 均顯著增加，且主要在 HUVEC 中表達(dá)。與 qRT-PCR 結(jié)果一致，D+E 共培養(yǎng)中 VEGFR1 分泌迅速增加（圖3 b）。

為探究 D+E-CM 是否介導(dǎo) D+E 共培養(yǎng)中 FLT-1 的上調(diào)，在有或無 IgG 的預(yù)孵育下在 D-CM 或 D+E-CM 中培養(yǎng) HUVEC 48 小時，發(fā)現(xiàn)暴露于 D-CM 會略微降低 sFLT-1 和 mFLT-1 表達(dá)（圖3 c），D+E-CM 暴露使 FLT-1 分泌增加4.8倍（圖3 d）。相比之下，中和抗體 IgG 部分消除了 D+E-CM 對 FLT-1 表達(dá)的刺激效應(yīng)。

為進一步評估升高的 FLT-1 是否消耗了共培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的大部分 VEGF，在與 DPSCs 共培養(yǎng)之前，用靶向 FLT‐1 （si‐FLT‐1）或 si‐NC 的 siRNA 轉(zhuǎn)染 HUVECs，共培養(yǎng)6天后，ELISA 結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染 si-FLT-1 的 HUVECs 共培養(yǎng)的 DPSCs 的 VEGF 濃度是對照組的1.56倍，這表明 HUVECs 中 FLT-1 的增加是共培養(yǎng)過程中 VEGF 耗竭的原因（圖3 e）。

用 Activin A 刺激 HUVECs 在第3天顯著上調(diào)了 FLT-1 表達(dá)。相比之下，編碼 VEGFR2 mRNA 的 KDR 僅略有增加（圖3 f）。Activin A 誘導(dǎo)了 HUVECs 中 VEGFR1/VEGFR2 mRNA 高比值。與 mRNA 表達(dá)一致，Activin A 在兩個時間點均顯著提升了 HUVECs 中 sFLT-1 分泌（圖3 g），還提高了 VEGFR1 蛋白的表達(dá)（圖3 h）。這些研究表明，Activin A 的抗血管生成效果部分源于其提升 VEGFR1/VGEFR2 表達(dá)比值的能力。

為進一步研究 Activin A 處理是否抑制 VEGF 誘導(dǎo)的 VEGFR2 激活，HUVECs 先用重組 Activin A 預(yù)處理48小時，隨后用 25 ng/mL VEGF 刺激15分鐘，發(fā)現(xiàn) VEGF 處理顯著增強 VEGFR2 的磷酸化，而 VEGF 誘導(dǎo)的 VEGFR2 磷酸化在 Activin A 預(yù)處理的 HUVEC 中降低（圖3 i）。高濃度的 VEGFR1 主要通過與 VEGFR2 競爭性地結(jié)合在 VEGF 上作為 VEGF 誘餌，阻止 VEGF/VEGFR2 信號的激活。

圖3      DPSC-HUVEC共培養(yǎng)和Activin A處理的HUVEC中VEGF受體的表達(dá)。

為確定導(dǎo)致 D+E-CM 中 Activin A 增加的細(xì)胞，收集共培養(yǎng)細(xì)胞并用 Dynabeads CD31 分離，將分離的 DPSCs 復(fù)制培養(yǎng)收集 CM，同時單培養(yǎng)的 DPSC 進行相應(yīng)的復(fù)制。與 HUVECs 共培養(yǎng)的 DPSCs CM 中 Activin A 的分泌水平遠(yuǎn)高于 DPSCs 單培養(yǎng)。與 DPSC 單培養(yǎng)相比，INHBA 在分離 DPSCs 中的 RNA 表達(dá)也有所增強。此外，從 D+E 直接共培養(yǎng)分離的 DPSCs 中，Activin A 的蛋白表達(dá)高于 DPSC 單培養(yǎng)和 D+E 間接共培養(yǎng)中的 DPSCs。這些結(jié)果表明，在 DPSC-HUVEC 共培養(yǎng)中主要是 DPSCs 分泌 Activin A ，且細(xì)胞間直接接觸培養(yǎng)對于觸發(fā) DPSCs 中的 Activin A 分泌至關(guān)重要。

最后，為了調(diào)查 Activin A 是否參與 DPSC-HUVEC 共培養(yǎng)中血管穩(wěn)定，在血管網(wǎng)絡(luò)形成后，將 sh-NC 轉(zhuǎn)染的 DPSCs 或 INHBA 敲低的 DPSCs 播種到基質(zhì)上。結(jié)果顯示，NC-DPSC 播種后，原有管狀網(wǎng)絡(luò)的分支點合并形成更大更厚的管狀結(jié)構(gòu)，NC-DPSCs 緊緊包裹著管狀結(jié)構(gòu)（圖4 a）。相比之下，添加 INHBA 敲低的 DPSC 使血管樣結(jié)構(gòu)的厚度和連接面積相比 NC‐DPSC‐seeded 組減少，說明敲低 Activin A 會抑制血管穩(wěn)定性。此外，當(dāng) HUVECs 與 INHBA 敲低的 DPSCs 共培養(yǎng)時，血管樣網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性被破壞，這表明 Activin A 在穩(wěn)定預(yù)形成血管結(jié)構(gòu)中的重要性。

圖4     添加NC-DPSC和Activin A敲低DPSC后，穩(wěn)定已有的血管樣結(jié)構(gòu)。

綜上所述，Activin A 在 DPSC-HUVEC 共培養(yǎng)過程中介導(dǎo)血管形成和穩(wěn)定，發(fā)揮重要作用。Activin A 通過增強 VEGFR1 表達(dá)，減少 VEGFR2 的磷酸化，微調(diào) VEGF 活性，從而抑制 HUVECs 的血管生成反應(yīng)（圖4 b）。該研究拓展了我們對 HUVECs 與 DPSCs 之間旁分泌相互作用的理解，后者有望成為促進牙髓再生中血管組織工程的潛在分子靶點。

參考文獻：Zhong J, Zhang Y, Lin S, Kang J, Hu M, Liu J, Chen Y, Jiang Q, Zhang C. Activin a regulates vascular formation and stabilization in direct coculture of dental pulp stem cells and endothelial cells. Int Endod J. 2025 Jul;58(7):991-1005. doi: 10.1111/iej.14226. Epub 2025 Mar 19. PMID: 40106315; PMCID: PMC12160993.

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