在生物制藥質量控制（QC）放行檢測中，活性檢測（Potency Assay）是衡量產品批間一致性、確保療效的關鍵環節。傳統ELISA方法雖然經典，但其繁瑣的洗滌步驟、較長的操作周期以及較高的變異系數，始終困擾著QC實驗室的效率和數據可靠性。而瑞孚迪（Revvity）的均相時間分辨熒光(Homogeneous Time-Resolved Fluorescence, HTRF) 的技術正在悄然改變這一局面。

HTRF技術憑借其免洗、高靈敏、高通量、信號穩定和易于自動化等核心優勢，正在成為生物制藥QC放行檢測中不可忽視的利器。從單克隆抗體到融合蛋白，從胰島素類似物到復雜生物制品，大量研究已證實HTRF方法在專屬性、準確性、精密度和線性等方面藥典驗證要求，且結果與傳統ELISA等效甚至更優。

HTRF技術原理

HTRF是一種結合了時間分辨熒光（TRF）與熒光共振能量轉移（FRET）的均相檢測技術。

在HTRF體系中，使用鑭系元素（如銪Eu3?、鋱Tb3?）的穴狀化合物作為熒光供體，其熒光壽命長達毫秒級，遠超普通熒光染料的納秒級。檢測時，通過設定幾十微秒的時間延遲，短壽命的背景熒光信號幾乎衰減，而長壽命的供體熒光信號得以被精確捕捉，從而顯著提高信噪比。

當供體（鑭系化合物）與受體（如XL665或d2染料）距離接近（<10 nm）時，供體的能量通過非輻射方式轉移至受體，激發受體發出特定波長的熒光信號（如665 nm）。熒光信號強度與待測生物分子的結合或活性呈正相關，從而實現精準定量。

圖1. HTRF原理圖

HTRF與ELISA方法學對比

與傳統ELISA相比，HTRF在QC放行場景中的優勢體現在多個維度：

阿達木單抗結合活性的對比研究明確證實，HTRF法與ELISA法測得的結果等效，可以替代ELISA用于該類單抗的結合活性測定[1]。

圖2. HTRF檢測阿達木單抗結合活性原理

表1 HTRF檢HTRF與ELISA法測定同一批樣品的結果比較

表2 HTRF與ELISA法測定10批樣品的結果比較

HTRF在QC放行中的應用案例

案例1：抗PD-1/PD-L1單抗藥物活性檢測

中檢院單抗室成功地構建了抗PD-1/PD-L1單抗藥物活性檢測方法，其操作簡便易行，專屬性強，準確性和精密度良好，回收率在80%~120%范圍內，總RSD為13%，線性相關系數在0.99以上，滿足測定的要求，可用于單抗藥物的活性檢測，也為其他單克隆抗體活性測定方法的建立提供參考[2]。

圖3. HTRF檢測PD-1/PD-L1原理

案例2：替度格魯肽生物學活性檢測

中檢院梁成罡團隊建立了檢測替度格魯肽體外生物學活性的HTRF法，通過競爭性免疫法檢測細胞中cAMP的量，反映替度格魯肽對GLP-2R的激活作用。該方法準確度高（相對偏倚：-2.946%~1.426%）、精密度好（GCV：3.228%~4.736%）、操作簡便、耗時短，可用于替度格魯肽產品的質量控制[3]。

圖4. HTRF檢測cAMP原理

案例3：德谷胰島素生物學活性檢測

中國藥科大學利用HTRF技術建立了德谷胰島素體外生物學活性檢測方法，依據2020版《中國藥典》四部通則9401、1431進行方法學驗證（相對偏倚：?4.1%～?0.9%，GCV均小于11%，線性R2≥0.98），結果均符合方法驗證指導原則和生物檢定統計法規定。該方法可用于研發、過程控制、終產品放行及生物類似藥的研究，具有成為現有藥典標準方法替代方法的潛力[4]。

圖5. HTRF檢測德谷胰島素原理

HTRF在QC放行中的方法驗證

上述案例表明，HTRF方法能夠滿足ICH Q2 R2等國際質量標準對CQA檢測的要求，涵蓋效價、純度及受體結合檢測等多個維度。《中國藥典》四部通則9401、1431為HTRF方法的驗證提供了明確的指導框架，涵蓋專屬性、相對準確性、精密度、線性和范圍等關鍵指標的評估要求。在實際應用中，HTRF方法驗證通常包括以下關鍵指標：

1. 專屬性：僅與目標抗原或抗體發生反應，無交叉反應。

2. 相對準確性：不同效價水平的相對偏倚在±20%范圍內。

3. 精密度：不同效價水平的GCV不超過20%。

4. 線性與范圍：理論相對活性與實際測得相對活性的相關系數在0.98以上。

5. 穩定性指示能力：可反映破壞性樣品的活性變化趨勢。

綜上，HTRF技術不僅在方法學上優于傳統ELISA，更在實際QC放行場景中得到了中檢院等權機構的驗證支持。對于生物制藥企業QC部門而言，引入HTRF方法可有效縮短檢測周期、降低操作變異、提升通量與自動化適配能力，同時滿足國內外藥典的嚴格驗證標準。隨著更多生物制品類型的方法學建立與推廣，HTRF有望逐步成為活性檢測的主流平臺技術，為生物藥質量控制提供更高效、更可靠的解決方案。

- 參考文獻 -

1. Chin Med Biotechnol,April 2022,Vol. 17,No. 2

2. Chin J Pharm Anal 2019,39(1)

3. Acta Pharmaceutica Sinica 2025, 60(1): 211?217

4. Acta Pharmaceutica Sinica 2024, 59(12): 3347?3353

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