手機版
化工儀器網手機版
化工儀器網小程序
官方微信
公眾號：chem17
掃碼關注視頻號
一、引言
DNA合成儀是合成生物學、分子生物學和基因組學研究的基石設備，其核心功能是將單個核苷酸（A、T、C、G）按照預設序列逐鏈組裝成寡核苷酸，并進一步拼接成基因乃至更長片段。當前商用設備全部采用成熟固相亞磷酰胺三酯合成工藝，依托氣液精密流體控制系統、自動化反應單元完成寡核苷酸定向合成。該技術具有高效、快速的偶聯以及起始反應物比較穩定的特點。
二、固相亞磷酰胺三酯法的基本概念
固相亞磷酰胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成，相鄰的核苷酸通過3'→5'磷酸二酯鍵連接。整個過程在固相支持物上進行，通常采用可控孔徑玻璃珠（CPG）作為固相載體。合成從鏈的3'端向5'端延伸，每接入1個脫氧核苷酸，完整執行脫保護—偶聯—蓋帽—氧化四步循環反應，儀器通過程序循環往復直至合成完整目標序列。
三、合成循環的四個核心步驟
一個標準的合成循環包含四個關鍵步驟：脫保護、偶聯、蓋帽（封端）和氧化。
1.脫保護（Deblocking）
在第一個循環開始前，連接在CPG上的第一個核苷酸（其3'端已固定）的5'末端被二甲氧基三苯甲基（DMT）保護基團封閉。循環的第一步是用酸性試劑溶液流過柱床，選擇性地去除5'-羥基的DMT保護基團，暴露出活性的5'-羥基，為下一個核苷酸的連接做好準備。DMT陽離子呈橙色，可通過紫外監測脫保護效率。
2.偶聯（Coupling）
在活化劑（如四唑類化合物）的存在下，下一個帶有5'-DMT保護的核苷亞磷酰胺單體（其3'端被活化）被泵入反應柱。亞磷酰胺保護的核苷酸單體與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，其3'端被活化。新單體的活化3'磷酸基團與上一步暴露出的5'-羥基發生親核縮合反應，形成不穩定的亞磷酸三酯鍵，從而將新單體連接到生長的寡核苷酸鏈上。這一步是關鍵化學反應，其效率直接決定合成鏈的得率和長度。
3.蓋帽（Capping）
偶聯步驟并非有效，總有少量生長鏈的5'-羥基未能參與反應。縮合反應中可能有極少數5'-羥基沒有參加反應。這些“失敗鏈”如果不加以處理，將在下一輪循環中繼續延伸，產生缺失一個核苷酸的“缺失序列”雜質。為此，在偶聯之后加入乙酰化試劑（如乙酸酐和N-甲基咪唑的混合物），與未反應的5'-羥基反應，使其乙酰化失活，在后續的合成循環中不再參與反應。這種短片段可以在純化時分離去除。
4.氧化（Oxidation）
偶聯步驟形成的亞磷酸三酯鍵為三價磷，化學性質不穩定。通過泵入碘/水/吡啶的氧化溶液，將其氧化為穩定的五價磷酸三酯鍵，即形成天然DNA分子骨架中的磷酸二酯鍵結構。這一氧化步驟防止了后續步驟中的水解斷裂。
上述四個步驟構成一個完整的合成循環，為DNA鏈增加了一個核苷酸。循環結束后，用乙腈等溶劑洗滌反應柱，去除多余的試劑和副產物，然后重復整個過程，直到整條鏈的序列合成完畢。整套反應全程惰性氣體（氬氣/氮氣）密閉保護，隔絕空氣、水汽破壞亞磷酰胺單體。
四、合成后的切割與脫保護
當整條寡核苷酸鏈合成完成后，最后一步是脫除所有堿基上的保護基（如苯甲酰基、異丁酰基等）以及主鏈上的保護基，并將合成的寡核苷酸從固相支持物上切割下來。通過濃氨水處理（通常55℃處理12-16小時），將DNA鏈從固相載體CPG上切割下來，同時去除堿基上的氨基保護基團和磷酸基團上的保護基團（如氰乙基）。
五、純化
切割與脫保護完成后，通過脫鹽、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）或高效液相色譜（HPLC）等方法進行純化，去除短片段、未脫保護的雜質及鹽類，得到高純度的DNA產物。成品引物可用C18濃縮、脫鹽、沉淀，沉淀后的引物用水懸浮，測定OD260定量。
六、DNA合成儀的自動化實現
整個合成過程由DNA合成儀自動完成。對于每條獨立的序列，合成儀會控制不同的閥門，從四個獨立的核苷酸單體儲液瓶中精確輸送特定的單體，實現序列的精確編碼。合成儀通常配備Trityl在線監測器，可實時監測偶聯效率。儀器通過精密控制的流體系統、高效的化學反應和自動化操作，將抽象的基因序列信息轉化為可操作的實體DNA分子。
固相亞磷酰胺三酯法通過“保護-脫保護-偶聯-氧化”的循環化學過程，在固相載體上實現了DNA鏈的定向逐步合成。該方法憑借其高效、穩定的特點，已成為DNA自動化固相合成的通用技術。DNA合成儀通過精密的流體控制系統和自動化操作，將抽象的基因序列信息轉化為實體DNA分子，為基因編輯、分子克隆、診斷探針開發、以及整個人工生命系統的構建提供了基礎工具。
免責聲明
- 凡本網注明“來源：化工儀器網”的所有作品，均為浙江興旺寶明通網絡有限公司-化工儀器網合法擁有版權或有權使用的作品，未經本網授權不得轉載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經本網授權使用作品的，應在授權范圍內使用，并注明“來源：化工儀器網”。違反上述聲明者，本網將追究其相關法律責任。
- 本網轉載并注明自其他來源（非化工儀器網）的作品，目的在于傳遞更多信息，并不代表本網贊同其觀點和對其真實性負責，不承擔此類作品侵權行為的直接責任及連帶責任。其他媒體、網站或個人從本網轉載時，必須保留本網注明的作品第一來源，并自負版權等法律責任。
- 如涉及作品內容、版權等問題，請在作品發表之日起一周內與本網聯系，否則視為放棄相關權利。
采購中心