“退火”能否一定程度替代“介入成核”

這不是一篇凍干科普文，這是一篇有點門檻的凍干文章；

如果你是這個行業(yè)的長期從業(yè)者，以下內容很值得閱讀；

如果只是做“簡單的凍干”，這篇可以忽略；

凍干行業(yè)兩大前沿技術：

凍干行業(yè)，有兩個前沿技術，分別解決工藝過程中的兩大難點：

Ø  升華界面溫度獲取（升華界面溫度軟件以及最近出現(xiàn)的芯片檢測）---解決產品升華界面溫度無法通過傳統(tǒng)硬件探頭準確測量的問題；

Ø  介入成核---解決預凍階段，因為“過冷”而導致的產品的各種問題；

如果你常常閱讀凍干相關文獻，會頻繁看見關于“介入成核”解決各種問題的研究；

“介入成核”目前有三種實現(xiàn)方式：

Ø  正壓法也叫減壓成核

pressurization/depressurization；

Ø  負壓法

vacuum-induced,（Telstar）；

Ø  冰霧法

ice-fog,；

對于介入成核原理和不同方法之間的優(yōu)缺點比較，可參考公眾號之前發(fā)的：

預凍篇（四）介入成核（瞬時結晶）

不同凍干機制造商，選擇了不同的方法；

但對于用戶來說，都有一個共同的問題：

貴

為了實現(xiàn)“介入成核”的目標，設備制造商們始終需要在凍干機的硬件和軟件上做一些改裝---你需要買一臺特別的凍干機或對現(xiàn)有凍干機進行一個“很不便宜”的改裝，以及針對你的產品研究有效的“介入成核”工藝；

雖然介入成核有以下已經被文獻論證了很多次的優(yōu)點：

Ø  大冰晶

Ø  產品內部孔徑均勻

Ø  批次之間均一和均勻

Ø  減少升華和整個凍干的時間

Ø  縮短重建時間

但因為“貴”這個問題，目前國內裝配“介入成核”功能的凍干機，很少（我所知道的，不超過3臺吧，而且貌似都沒有在生產上真正的用起來？

我們實驗室裝配了TELSTAR LYOBETA配備負壓法“介入成核”，目前我還只做了一些簡單樣品的實驗室規(guī)模實驗；

了解更多不同“介入成核”方法在生產凍干機，針對實際產品改善應用效果的用戶可以和我聯(lián)系，我們對于這個功能交流一下分別的看法；

但是，看一下上面列出的優(yōu)點，再結合我前兩天發(fā)的文章：

關于退火，你想知道的“一切”？

有沒有發(fā)現(xiàn)，退火工藝的作用，和介入成核高度重合？

區(qū)別是：退火只是一個特殊的工藝設置，雖然溫度、持續(xù)時間也需要通過實驗數(shù)據(jù)做更深入的研究；

但對于客戶來說，不需要增加額外投資；

在凍干工藝這個領域，始終“技術就是效率”，更好的技術意味著更短的工藝時長、更低的產品損耗-------好的技術，就是可以讓你的成本更低；

效果好；

這也是為什么，我的線下凍干工藝培訓會，從來不贈送任何免費名額的原因；

來聽課，實在是性價比高的投資；

對于學員是，對于老板來說，其實更是；

言歸正傳，讓我們重新來看，能否用避免額外投資的“退火”

來一定程度替代

高額投資的“介入成核”

我們將會對一個產品執(zhí)行相同的凍干工藝，只是在預凍階段分別加入：

l  在-6℃的溫度下，執(zhí)行介入成核；

l  -6℃的退火溫度執(zhí)行退火；

運行如下凍干工藝：

*總時長包含退火和介入成核需要的平衡時間

繼而評估兩種方法對以下參數(shù)的影響：

l  蛋糕結構；

l  復溶時間；

l  比表面積；

*實驗樣品：50mg/ml gG2單克隆抗體處方（10mM組氨酸緩沖液pH5.5、8%蔗糖、0.2mg/ml吐溫20）；

灌裝：0.22um濾膜過濾后，10ml西林瓶4ml裝量

一次干燥時間：

三種預凍條件下得到的凍干曲線如下：

由以上曲線可以看出：

預凍中引入介入成核和退火，和傳統(tǒng)板層降溫預凍方式相比，一次干燥時間約節(jié)約了30%；

*Awotwe-Otoo等人將傳統(tǒng)預凍方式與介入成核進行了比較，初級干燥時間減少了19%。

Konstantinidis等人報道的一項類似研究使用介入成核，將初級干燥時間減少了41%。

預凍階段，形成的蛋糕結構是影響后續(xù)一次干燥階段升華阻力的主要因素；

已干燥相對升華水蒸氣的阻力，是表征冰晶尺寸如何影響一次干燥階段產品溫度和干燥速率的重要因素；

圖一：蛋糕阻力藍色：介入成核、綠色：板層降溫、橘色：退火

*其他研究表明：在-3℃下實施介入成核可以使得干燥相阻力減少25%，在-15℃下退火6小時達到的阻力減小相似；我們在上一篇文章中也提到，退火所能達到的效果，和你選擇的溫度以及保持時間有關；

蛋糕結構

圖二：A：傳統(tǒng)板層降溫預凍、B：-6℃退火、C：介入成核

圖三：凍干后蛋糕結構電鏡掃描圖像：

A：傳統(tǒng)板層降溫預凍、B：-6℃退火、C：介入成核

上排圖像從蛋糕頂部拍攝，下排圖像從蛋糕底部拍攝

三種不同預凍方式得到的蛋糕結構有比較大的不同；

傳統(tǒng)板層降溫得到的蛋糕，孔徑最小（和上文提到的，升華阻力最大一致）；

孔徑：傳統(tǒng)板層預凍＜退火＜介入成核；

國內用戶需要特別注意的一點是：對于外觀的評估；

國內凍干產品，對于外觀的關注有時候甚至遠遠超過對CQA和凍干效率（凍干工藝成本）的關注；

那么，在考慮使用特殊預凍方式的時候，對于外觀的影響是必須要考慮到的一個影響；

因為大家對于外觀比較關注，再補充一組外觀圖片：

圖四：a板層降溫預凍：外觀更加致密蛋糕邊緣和底部有輕微收縮

b介入成核：外觀更加多孔，邊緣底部無收縮

C板層降溫預凍SEM電鏡掃描圖像

D介入成核電鏡掃描圖像

一次干燥時間、水分、復溶時間和比表面積

如上表：三種預凍方式，因為冰晶大小不同，所得到的最終產品的比表面積也不同；

比表面積：傳統(tǒng)板層降溫預凍＞退火≥介入成核；

產品的最終水分，是和比表面積相關的指標，比表面積越大，最終水分則有可能做到更低；

因此產品最終水分：傳統(tǒng)板層降溫預凍＜退火＜介入成核；

對于產品最終水分是難點的產品，很多時候既要考慮退火、介入成核工藝給產品帶來的工藝時長的縮短，也要考慮對最終水分升高帶來的影響；

具體是否可以采用，以及使用什么樣的參數(shù)，還是需要實驗數(shù)據(jù)來確定；

最后的話：

預凍階段的成核是個隨機現(xiàn)象，這個隨機現(xiàn)象導致的冰晶大小不均一，是導致一次干燥時間過長以及最終產品不均一問題的重要原因之一；

最新的“介入成核”技術，可以解決成核不均一的問題；

但因為成本的原因，國內在實際生產中應用非常少；

退火的作用，在很多方面都和介入成核重合，具體能達到多少效果，本文提供了一些實驗數(shù)據(jù)；

除了縮短一次干燥時間，大冰晶還會導致產品外觀粗糙、比表面積小，最終水分變高等參數(shù)的變化；

關于退火，已經連續(xù)寫了兩篇了；

我盡量從機理到數(shù)據(jù)，給這個工藝有可能給產品帶來的影響做了一些闡述；

但非常非常重要的一點是：并不是所有的工藝，都需要加入“退火”；

所有的作用，都只是針對某些產品的一種“可能性”；

實際上，在我們的實驗室，針對每個產品進行研究，退火真的起作用的產品，低于30%；

所以很多時候，我們做的不是給用戶原本的工藝加上“退火”而是去掉“退火”；

只有在實驗數(shù)據(jù)證明，這個工藝確實對產品有“正向”作用的時候，才添加此操作；

在應用一個技術的時候，深入理解其原理，全面了解其對產品各方面的影響是很重要的；

最后針對每個特定的產品，始終還是需要自己進行實驗，以獲得確定的數(shù)據(jù)支持；

特別感謝TELSTAR一直以來提供LYOBETA系列中試凍干機，在任何時候都為我提供數(shù)據(jù)和實驗支持；

特別感謝昊擴科技，提供凍干顯微鏡、DSC設備、實驗人員以及其他財政支持.

參考文獻：

[1]Gieseler H, Startzel P. Controlled nucleation in freeze-drying. Eur Pharm Rev. 2012. Available at: https://www.europeanpharmaceuticalreview。。ｃｏｍ/article/15427/con trolled-nucleation-in-freeze-drying/. Accessed October 22, 2012 .

[2] Chessalov S, Latshaw D, Nulu S, Sharp T, Ewan S, Chen X. Application of first principles primary drying model to lyophilization process design and transfer: case studies from the industry. J Pharm Sci. 2021 Feb;110:968–981

[3]Konstantinidis AK, Kuu WEI, Otten L, Nail SL, Sever RR. Controlled nucleation in freeze-drying: effects on pore size in the dried product layer, mass transfer resistance, and primary drying rate. J Pharm Sci. 2011;100(8):3453–3470. 24.

[4]Awotwe-Otoo D, Agarabi C, Read EK, et al. Impact of controlled ice nucleation on process performance and quality attributes of a lyophilized monoclonal antibody. Int J Pharm. 2013;450(1-2):70–78.

文章來源——凍干工藝之家公眾號  •  星德科 TELSTAR 凍干工藝實驗室