研究背景

隨著人口老齡化的進程加快，越來越多的老年人被骨關節炎的疼痛困擾，而基于干細胞的骨關節炎和軟骨缺損療法展現出優秀的臨床轉化前景。其中，脂肪來源的干細胞（ADSCs）來源豐富、獲取便捷、低創傷，正成為組織工程與細胞治療中優質的“種子細胞”。今天，就讓我們一同走進實驗室，盤點小鼠脂肪來源干細胞的分離培養與成軟骨分化實驗。

一、小鼠原代ADSC分離培養

小鼠ADSC細胞從腹股溝脂肪組織中分離。在小鼠死后用75%乙醇浸泡消毒，重復三次后在超凈臺中解剖，獲取腹股溝脂肪組織。將其在PBS緩沖液中多次洗滌后，使用眼科剪剪碎，1-3mm3的小顆粒。在DMEM培養基中添加2 mg/ml Collagenase A、2%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗配制成消化液，使用0.22μm孔徑的濾膜過濾除菌，將上述脂肪組織顆粒轉移入消化液中，置于37℃搖床上振蕩消化15分鐘。

消化完成后，使用40μm孔徑的尼龍篩網過濾消化液，棄去未消化的組織顆粒。濾液離心后的沉淀即為原代細胞。使用含20%胎牛血清的DMEM培養基重懸沉淀，計數后每個T75培養瓶中接種50萬細胞，置于5% CO2培養箱中進行培養。每3天更換一次培養基，待達到80%融合度時使用含EDTA的胰酶進行消化傳代。培養過程中，培養基中添加堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）（貨號：50037-M07E）可促進MSC生長。

Note所使用的義翹產品

· 產品名稱：堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）

· 產品貨號：50037-M07E

圖1. 顯微鏡下P0代(A) 和P1代(B) ADSC的典型形態

二、誘導ADSC成軟骨分化

成軟骨誘導實驗首先需要形成細胞凝聚體（3D MSC pellet）。細胞胰酶消化后以300 g離心力離心5分鐘，棄去上清后使用前述完-全培養基重懸細胞，計數、稀釋至每毫升20萬的細胞密度。15mL離心管中加入1mL細胞懸液，以450 g離心力離心10分鐘，小心轉移至培養箱后，稍懸松離心管口促進氣體交換，注意不要晃動沉淀。過夜靜置培養（16小時以上）形成細胞凝聚體。

圖2. 培養箱中使用15mL培養管培養細胞凝聚體的實拍圖

配制成軟骨分化的誘導培養基：向DMEM培養基中添加1X ITS添加劑、0.1 mM地塞米松、2 mM谷氨酰胺、10 ng/mL TGF-beta 1（貨號：80116-RNAH），渦旋混勻。

Note所使用的義翹產品

· 產品名稱：TGF-beta 1

· 產品貨號：80116-RNAH

成軟骨分化培養：小心吸去培養管中的原有培養基，更換為成軟骨分化培養基，重新置于培養箱中開始成軟骨分化（圖3圓圈中）。

圖3. 成軟骨分化形成的細胞球實拍圖

三、成軟骨分化表型檢測

在前述培養條件下，間充質干細胞逐漸發生軟骨分化。分化早期細胞聚集體中不含軟骨特異性分子，膠原種類以I型膠原蛋白為主。約5天后，細胞外基質中可逐漸檢測到II型膠原蛋白。約2-3周后整個細胞凝聚體中合成以II型膠原蛋白聚糖為代表的軟骨特異性分子，產生豐富的細胞外基質，進行成軟骨分化評估實驗。

制作切片并染色定性評估

誘導三周后收取細胞凝聚體，浸泡在中性多聚甲醛固定液中固定24小時。經梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋等步驟制作5-7μm厚度的石蠟切片。切片依次經二甲苯和梯度乙醇浸泡后，使用去離子水沖洗5分鐘。充分水化后使用甲苯胺藍染色液浸染1-2分鐘，去離子水沖洗、乙醇脫水、二甲苯透明后進行封片，在顯微鏡下觀察和拍攝。分化良好的軟骨細胞外基質將被甲苯胺藍染料染色為深藍紫色。切片也可用于進行軟骨特異性指標（如COL2 1和ACAN）的免疫組化及免疫熒光染色，根據染色圖像定性評估分化水平。

使用分光光度計定量評估

使用木瓜蛋白酶溶液將細胞凝聚體消化，充分離心后取上清液。對于凝聚體中的細胞數量，可以通過Hoechst 33258（0.7 μg/ml）染料檢測樣品中的DNA含量來定量評估，即使用DNA標準品與待測凝聚體消化液分別與染料混合，在340 nm的激發波?和465 nm的發射波?下讀取板，通過標準曲線計算樣本中的 含量。對于凝聚體中軟骨細胞外基質，可使用番紅O染料測量樣本中的蛋白聚糖含量，用于定量比較細胞外基質的積累程度。

使用qPCR定量評估

除了評估上述的細胞外膠原基質，我們在分化實驗中也常常需要檢測關注的信號通路等因子的表達情況，這時則需要使用TRIzol裂解液消化，提取每個細胞凝聚體中的總RNA，使用qPCR的方法檢測Sox9、Col2a1、Acan等軟骨相關因子和研究所關注的信號通路相關指標的表達情況。

實例分析

脂肪來源間充質干細胞進一步研究結果

脂肪來源間充質干細胞的培養及成軟骨分化僅是實驗的開始，研究人員進一步將實驗材料用于骨關節炎（OA）治療方法的研究。研究結果發表于Journal of Extracellular Vesicles期刊。

通過上述步驟，我們成功地完成了從小鼠脂肪組織中分離原代ADSC、在體外進行擴增培養，到誘導其向軟骨細胞分化，并最終通過甲苯胺藍染色、II型膠原免疫熒光染色等技術驗證分化成果的全過程。本實驗中應用到義翹神州的重組bFGF（Cat: 50037-M07E）蛋白和TGF-b1（Cat: 80116-RNAH）蛋白，對于促進ADSC增殖和分化至關重要。希望優質的重組蛋白能夠為大家的實驗順利開展保駕護航，探索ADSC成軟骨分化的神奇世界。

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【參考文獻】

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