一、試劑與耗材準(zhǔn)備

1. 原料

1. COOH-TK-COOH（雙羧基硫縮酮）

2. 氨基底物：NH?-PEG、多肽、明膠、氨基修飾納米粒、蛋白等

3. 活化劑：EDC?HCl、NHS

2. 緩沖體系（關(guān)鍵：pH 4.5–6.0，無氨基干擾）

3. 配套試劑

二、摩爾配比（通用優(yōu)化比例）

三、完整操作步驟（分兩步：先活化羧基，再偶聯(lián)氨基）

步驟 1：羧基預(yù)活化（無水 / 低水相，避光室溫 30 min）

1. 稱取 COOH-TK-COOH，用少量純 DMSO 充分溶解（母液濃度 50–100 mg/mL）

2. 加入 MES 緩沖液稀釋，體系 DMSO 含量≤20%，避免蛋白變性

3. 依次加入 NHS、EDC?HCl，渦旋混勻，用稀酸微調(diào) pH 至 5.2–5.6

4. 避光室溫?cái)嚢杌罨?30 min

原理：COOH + EDC/NHS → NHS 活性酯中間體，中間體在 pH5.5 穩(wěn)定性最高

步驟 2：與氨基底物偶聯(lián)反應(yīng)（避光，室溫 4–12 h）

1. 將氨基底物溶于同一份 MES 緩沖液，緩慢滴入活化后的 TK 溶液

2. 全程監(jiān)測(cè) pH，維持 5.0–6.0；pH 過低酰胺鍵難形成，過高活性酯快速水解

3. 避光磁力攪拌：

• 小分子多肽 / PEG：4 h

• 蛋白、高分子凝膠基質(zhì)：8–12 h

步驟 3：終止反應(yīng)與純化

1. 終止：加入甘氨酸至終濃度 50 mM，攪拌 30 min，淬滅剩余活性酯

2. 純化分兩種場(chǎng)景：

場(chǎng)景 A：小分子產(chǎn)物（TK-PEG、TK - 多肽）

場(chǎng)景 B：納米粒 / 蛋白 / 水凝膠

四、產(chǎn)物表征驗(yàn)證方法

1. 1H NMR：對(duì)比反應(yīng)前后羧基特征峰消失，出現(xiàn)底物特征峰，證明偶聯(lián)成功

2. 紅外 FTIR：1700 cm?1 羧基峰減弱，1640 cm?1 酰胺鍵 C=O 特征峰增強(qiáng)

3. HPLC / 質(zhì)譜：檢測(cè)游離 COOH-TK-COOH 殘留，計(jì)算偶聯(lián)效率

4. ROS 響應(yīng)驗(yàn)證：配 100 μM H?O?溶液，37 ℃孵育 2–6 h，核磁 / 色譜檢測(cè) TK 鍵斷裂降解

五、關(guān)鍵注意事項(xiàng)（避坑要點(diǎn)）

1. pH 絕對(duì)不能大于 6.5：NHS 活性酯水解速度急劇加快，大幅降低偶聯(lián)率

2. 全程無伯胺雜質(zhì)：Tris、甘氨酸、氨基類緩沖鹽會(huì)競(jìng)爭(zhēng)消耗活化位點(diǎn)

3. COOH-TK-COOH 遇氧化環(huán)境易分解，活化、反應(yīng)全程避光，避免長(zhǎng)期暴露空氣

4. 若底物為蛋白，DMSO 比例控制＜10%，防止蛋白變性失活

5. 現(xiàn)配現(xiàn)用 EDC/NHS，水溶液中活化劑易水解失效，不要提前配制混合液