一、 研究背景

化膿性鏈球菌可引發(fā)輕重差異極大的各類感染，全球每年超50萬(wàn)人死于重癥感染，感染損傷異質(zhì)性機(jī)制尚不清晰。區(qū)別于清除病原體的免疫抵抗，疾病耐受性通過減輕免疫病理?yè)p傷保護(hù)組織；該菌有氧發(fā)酵關(guān)鍵酶丙酮酸脫氫酶復(fù)合體（PDH）可獨(dú)立調(diào)控組織損傷，其代謝生成的乙酸、甲酸等短鏈脂肪酸能調(diào)控免疫，但完整作用通路尚不明確。

已有研究發(fā)現(xiàn)PDH可抑制抗炎修復(fù)因子IL-10、加重皮膚潰瘍，但其代謝產(chǎn)物調(diào)控巨噬細(xì)胞IL-10的胞內(nèi)代謝及表觀機(jī)制、靶向PDH緩解組織損傷的療效仍缺乏系統(tǒng)驗(yàn)證。依托特異性原核PDH小分子抑制劑，該篇文章借助小鼠壞死性皮膚感染模型，闡明發(fā)酵產(chǎn)物通過乙酰輔酶A及蛋白乙?；厮芫奘杉?xì)胞免疫的分子機(jī)制，驗(yàn)證PDH抑制劑減輕感染組織損傷的應(yīng)用潛力。

二、 研究結(jié)果

1、 PDH對(duì)促進(jìn)潰瘍進(jìn)展和晚期感染是必需

研究人員在皮下感染模型中發(fā)現(xiàn)，野生型（WT）菌株所致潰瘍持續(xù)擴(kuò)大至第6天，而ΔPdh菌株的潰瘍?cè)诟腥竞?天即停止進(jìn)展，面積顯著小于WT。盡管兩菌株在感染后3天的組織載菌量無(wú)差異，ΔPdh從第6天開始以更快速度被清除。提示PDH對(duì)于潰瘍進(jìn)展和晚期感染的維持至關(guān)重要，且其作用獨(dú)立于細(xì)菌在組織中的生長(zhǎng)能力。

2、 ARMAF 改變了細(xì)胞免疫應(yīng)答的組成

研究人員通過化學(xué)發(fā)光成像技術(shù)，感染后1h發(fā)現(xiàn)WT菌招募了更多的活性氧（ROS）產(chǎn)生細(xì)胞，該效應(yīng)主要來(lái)自中性粒細(xì)胞（抗Gr1抗體可消除）。感染后3天的流式細(xì)胞分析表明，ΔPdh感染組織中巨噬細(xì)胞數(shù)量約為WT的5倍，中性粒細(xì)胞約1.5倍。單細(xì)胞RNA測(cè)序進(jìn)一步鑒定了15個(gè)免疫細(xì)胞亞群，ΔPdh感染導(dǎo)致巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞比例升高，并引起B(yǎng)細(xì)胞和T細(xì)胞內(nèi)干擾素及細(xì)胞因子信號(hào)通路的差異表達(dá)。以上數(shù)據(jù)表明，有氧混合酸發(fā)酵（ARMAF）通過PDH重塑了感染局部的細(xì)胞免疫應(yīng)答組成。

3、 PDH有助于細(xì)胞外生長(zhǎng)以及依賴免疫細(xì)胞的細(xì)菌清除

研究人員通過免疫熒光發(fā)現(xiàn)，WT鏈球菌主要呈胞外聚集，被中性粒細(xì)胞包圍；ΔPdh鏈球菌則大量存在于巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞內(nèi)部。透射電鏡發(fā)現(xiàn)ΔPdh感染的巨噬細(xì)胞中含更多胞內(nèi)細(xì)菌且細(xì)胞核損傷較輕。巨噬細(xì)胞清除實(shí)驗(yàn)（氯膦酸鹽脂質(zhì)體）導(dǎo)致WT感染小鼠死亡率達(dá)70%且細(xì)菌載量升高，而ΔPdh感染小鼠僅10%死亡；中性粒細(xì)胞清除（抗Gr?1抗體）則加重WT所致組織損傷但ΔPdh不受影響。這些結(jié)果表明，PDH幫助細(xì)菌維持胞外生活方式并逃避巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的清除，而巨噬細(xì)胞主要控制載量，中性粒細(xì)胞主要限制損傷。

4、 ARMAF 會(huì)抑制抗炎和傷口愈合反應(yīng)

研究人員利用10BiT（g IL-10細(xì)菌人工染色體（BAC）轉(zhuǎn)基因） IL10報(bào)告小鼠，ΔPdh感染組織中表達(dá)Thy1.1（IL10替代標(biāo)志）的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞比例及平均熒光強(qiáng)度均高于WT，而T細(xì)胞無(wú)差異。scRNAseq顯示ΔPdh感染的中性粒細(xì)胞中IL10信號(hào)通路上調(diào)，巨噬細(xì)胞偏向M2表型（高表達(dá)Tgm2、Vegfa等修復(fù)相關(guān)基因），WT則偏向M1表型（高表達(dá)IL1β、CCL3）。免疫熒光證實(shí)ΔPdh感染的巨噬細(xì)胞高表達(dá)M2標(biāo)志物CD163和CCL22。因此，研究結(jié)果提示ARMAF通過PDH抑制了髓系細(xì)胞來(lái)源的IL10表達(dá)和傷口愈合程序。

5、 ARMAF產(chǎn)生的短鏈脂肪酸通過改變宿主乙酰輔酶A的水平來(lái)調(diào)節(jié)IL-10的表達(dá)

研究人員發(fā)現(xiàn)，WT菌感染巨噬細(xì)胞后上清中乙酸和甲酸濃度顯著高于ΔPdh。向ΔPdh感染體系外源補(bǔ)充乙酸（1 mM）和甲酸（50 µM）可恢復(fù)細(xì)菌胞內(nèi)持久性并使IL?10降至WT水平。同時(shí)，ΔPdh感染的巨噬細(xì)胞中乙酰輔酶A水平顯著低于WT，補(bǔ)充乙酸/甲酸后可上調(diào)乙酰輔酶A。多種GPCR及腺苷受體拮抗劑不影響上述現(xiàn)象，提示作用依賴于代謝而非受體信號(hào)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示，廣譜HDAC抑制劑曲古抑菌素Awan全抑制WT和ΔPdh感染誘導(dǎo)的IL?10表達(dá)，且對(duì)細(xì)菌存活無(wú)影響。分別抑制Class I、IIa、IIb HDAC無(wú)效，三者聯(lián)用才可重現(xiàn)TSA效果。RNA?seq顯示TSA對(duì)WT感染巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組影響很小，但對(duì)ΔPdh感染細(xì)胞引起大量基因差異表達(dá)，說(shuō)明WT感染已使乙?；幱谳^高水平，抑制去乙?；蛇M(jìn)一步增強(qiáng)乙酰化從而wan全阻斷IL?10。綜上，研究結(jié)果提示PDH來(lái)源的乙酸經(jīng)宿主代謝提升乙酰輔酶A，通過增加蛋白乙?；ò悬c(diǎn)非組蛋白）抑制IL?10，而抑制HDAC可放大該效應(yīng)。

6、 利用PDH抑制劑H8重新調(diào)節(jié)碳流可減輕組織損傷

研究人員從20個(gè)細(xì)菌PDH選擇性抑制劑中篩選出化合物H8，其在有氧條件下有效抑制WT菌生長(zhǎng)。體外巨噬細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)中，H8處理使WT菌的胞內(nèi)存活率下降、IL?10水平升高至與ΔPdh相似。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，WT感染小鼠從感染即刻開始在病灶局部每日注射H8（40 mg/kg），3天后潰瘍面積顯著小于未治療組，而細(xì)菌載量無(wú)差異；ΔPdh感染小鼠加用H8無(wú)額外效果。表明通過化學(xué)抑制PDH重編程碳流，可在不減少細(xì)菌負(fù)荷的條件下減輕組織損傷，驗(yàn)證了PDH作為治療靶點(diǎn)的可行性。

三、 研究結(jié)論

該篇研究發(fā)現(xiàn)，化膿性鏈球菌通過其有氧混合酸發(fā)酵途徑中的PDH酶，產(chǎn)生乙酸和甲酸，進(jìn)入宿主巨噬細(xì)胞后提升乙酰輔酶A水平，增強(qiáng)蛋白乙?；?，從而抑制抗炎因子IL-10的表達(dá)，導(dǎo)致低IL-10/高TNFα的失衡，延緩傷口愈合，加重組織損傷。當(dāng)PDH活性缺失或被藥物抑制時(shí)，乙酸和甲酸產(chǎn)量下降，IL-10表達(dá)上調(diào)，招募更多免疫細(xì)胞，啟動(dòng)傷口愈合，減輕組織損傷。因此，使用細(xì)菌特異性PDH小分子抑制劑H8重新編程細(xì)菌碳代謝，可在不干擾細(xì)菌清除的前提下，有效減輕感染引起的組織損傷。