百歐博偉生物：發酵乳中細菌檢測核心圍繞目標益生菌（如乳酸菌）的定量/定性、雜菌（致病菌）的篩查/鑒定展開，需遵循標準化操作流程以保證結果準確、可重復，以下是全維度的檢測體系：

一、檢測前準備

1、樣品處理

取樣原則：遵循 GB 4789 系列標準，無菌操作采集發酵乳樣品（液體/凝固型），凝固型需先無菌均質（加入無菌生理鹽水/磷酸鹽緩沖液，1:9 稀釋），液體型直接梯度稀釋（10?1~10??）。

稀釋液要求：采用 0.85% 無菌生理鹽水或 PBS 緩沖液（pH 7.0~7.2），稀釋過程全程無菌，避免交叉污染。

2、培養基與耗材準備

檢測目標       核心培養基     培養基原理     耗材要求

乳酸菌（總）  MRS 培養基（含瓊脂）  含酪蛋白胨、酵母膏、葡萄糖，適合乳酸菌厭氧/微需氧生長  無菌培養皿、移液管、厭氧培養袋/罐

雙歧桿菌  MRS-LP 培養基（添加鋰鹽 + 環絲氨酸）  抑制其他乳酸菌，僅雙歧桿菌生長  同上，需嚴格厭氧環境

大腸桿菌（雜菌）  伊紅美藍（EMB）培養基  乳糖發酵產酸，大腸桿菌菌落呈紫黑色帶金屬光澤  無菌涂布棒、恒溫培養箱

金黃色葡萄球菌  Baird-Parker 培養基  含卵黃乳液，金黃色葡萄球菌形成黑色菌落  革蘭氏染色液、生化鑒定管

霉菌/酵母菌  孟加拉紅培養基  含氯霉素抑制細菌，霉菌/酵母形成特征菌落  無菌吸管、25℃培養箱

二、核心檢測流程

1、乳酸菌（發酵乳核心功能菌）檢測

（1）定量檢測（平板計數法，GB 4789.35）

梯度稀釋：取 1mL 稀釋液（選 10??、10??、10??三個稀釋度）加入無菌培養皿，每個稀釋度做 3 個平行。

倒平板：加入冷卻至 45~50℃的 MRS 瓊脂培養基，輕輕搖勻，待凝固后倒置。

培養條件：微需氧環境（厭氧袋 + 產氣包），37℃培養 48~72h（雙歧桿菌需嚴格厭氧，培養 72h）。

計數規則：選取菌落數在 30~300cfu 的平板計數，計算公式：總菌數（cfu/g/mL）= 菌落數 × 稀釋倍數 × 10（因初始稀釋為 1:10）。

（2）定性鑒定（確認菌種）

菌落形態觀察：乳酸菌在 MRS 平板上為圓形、乳白色、邊緣整齊、表面光滑的菌落。

生化鑒定：革蘭氏染色（陽性，無芽孢）、觸酶試驗（陰性）、糖發酵試驗（發酵葡萄糖、乳糖產酸不產氣）。

分子鑒定（精準分型）：提取菌落 DNA，進行 16S rRNA 基因擴增測序，對比 GenBank 數據庫確認菌種（如保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌）。

2、雜菌（致病菌）篩查

（1）大腸桿菌（GB 4789.6）

增菌培養：取 10mL 樣品加入 90mL LB 增菌液，37℃培養 18~24h。

分離培養：取增菌液劃線接種 EMB 平板，37℃培養 24h，觀察特征菌落。

確認試驗：挑取可疑菌落進行乳糖發酵、靛基質試驗、甲基紅試驗，陽性判定為大腸桿菌（發酵乳中不得檢出）。

（2）金黃色葡萄球菌（GB 4789.10）

增菌：取 25g 樣品加入 225mL 7.5% 氯化鈉肉湯，37℃培養 24h。

分離：劃線接種 Baird-Parker 平板，37℃培養 24~48h，觀察黑色菌落（周圍有渾濁圈）。

確認：血漿凝固酶試驗陽性（核心判定指標），發酵乳中不得檢出。

（3）霉菌/酵母菌（GB 4789.15）

接種：取 1mL 稀釋液涂布孟加拉紅平板，25℃培養 5~7d。

計數：統計菌落數，發酵乳中霉菌/酵母通常≤100cfu/g（不同產品標準略有差異）。

三、質量控制要點

空白對照：每次檢測設置培養基空白（僅加培養基）、稀釋液空白（加稀釋液 + 培養基），確保無雜菌污染。

平行樣要求：同一稀釋度至少 3 個平行，菌落數相對偏差≤10%，否則重新檢測。

培養環境校準：定期校準培養箱溫度（誤差 ±1℃）、厭氧罐氧氣濃度（乳酸菌培養需 O?＜2%）。

培養基質量：每批次培養基需做適用性驗證（接種標準菌株，如保加利亞乳桿菌 ATCC 11842，確認生長良好）。

四、常見問題及失效原因分析

1、乳酸菌計數結果偏低

原因：稀釋過程操作不當（如稀釋液溫度過高殺死菌）、培養環境氧濃度過高、培養基過期/pH 偏差（MRS 培養基 pH 需調至 6.2~6.4）。

解決：嚴格控制稀釋液溫度（室溫），確認厭氧袋產氣正常，培養基使用前校準 pH。

2、平板雜菌過多

原因：取樣/稀釋過程無菌操作不嚴格、培養基滅菌不（高壓蒸汽滅菌需 121℃ 15min）、培養箱污染。

解決：操作在超凈工作臺進行，培養基滅菌后做無菌檢查，定期消毒培養箱。

3、雙歧桿菌分離失敗

原因：MRS-LP 培養基添加的鋰鹽/環絲氨酸濃度不當、厭氧環境不足。

解決：嚴格按配方添加抑制劑（鋰鹽 50mg/L、環絲氨酸 100mg/L），使用厭氧工作站而非僅厭氧袋。

五、前沿檢測技術（快速檢測）

qPCR 定量：針對乳酸菌特異性基因設計引物，實時熒光定量 PCR，1~2h 出結果，精準定量且可區分菌種。

流式細胞術：熒光染色后快速計數活菌（活細菌細胞膜完整，可被熒光染料標記），適合大批量樣品快速篩查。

生物傳感器：基于特異性抗體識別目標菌，通過信號放大實現快速定性，檢測時間＜30min，適合現場快速檢測。

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