冷凍電鏡斷層成像（cryo-ET）能在細胞原生環(huán)境解析三維分子結(jié)構(gòu)，但大組織、多細胞樣本前處理長期是行業(yè)難點。2023年北京大學郭強團隊在Journal of Structural Biology提出了一套全商用設(shè)備適配的高效組織cryo-FIB制樣流程；以小鼠胰島為模型，測出胞內(nèi)原生胰島素晶體晶格參數(shù)，實現(xiàn)組織原位高分辨結(jié)構(gòu)解析，為厚組織樣本原位分子電鏡研究提供標準化方案。

一、組織cryo-ET難在哪？

1、cryo-ET核心優(yōu)勢與天然局限

單顆粒冷凍電鏡需要純化蛋白，會破壞細胞內(nèi)天然分子互作；cryo-ET無需分離組分，可直接解析細胞三維原位分子架構(gòu)。

但受限于電子束的穿透能力，冷凍透射電鏡（cryo-TEM）要求樣品厚度控制300 nm以內(nèi)，但絕大多數(shù)完整細胞和組織切片而言，必須通過冷凍聚焦離子束（cryo-FIB）或冷凍超薄切片機（Leica EM FC7/UC Enuity）減薄，制備出電子透明薄片（lamella）。

2、當前組織制樣的三大痛點

1.高壓冷凍保護/填充劑干擾

傳統(tǒng)高壓冷凍用十六烯作為冷凍填充劑，樣品被厚保護層包裹，難以定位目標組織區(qū)域；改用2-甲基戊烷的方案需真空升華30分鐘，且殘留培養(yǎng)液會顯著降低制樣成功率。

2.傳統(tǒng)提取工藝耗時且門檻高

傳統(tǒng)的商用夾持式機械手提取單塊薄片效率低下、通量受限，且高度依賴定制原型設(shè)備，難以在普通實驗室普及。

3.組織與單細胞體系差異巨大

懸浮細胞和細胞系的FIB減薄流程無法直接適配多層致密組織；目前，行業(yè)內(nèi)仍缺乏一套模塊化、標準化且具備高度可落地性的完整制樣流水線。

總體而言，現(xiàn)有的組織制樣方法多停留在理論方案階段，缺乏經(jīng)過完整優(yōu)化和實測驗證的標準化流水線。建立一套高效、穩(wěn)定、可落地的完整工作流，正是本研究的核心突破口。

二、全新大組織樣品制備工作流

大組織樣品制備工作流全流程均基于成熟的商用設(shè)備搭建無需依賴定制儀器，從而顯著降低了技術(shù)門檻并提升了方法的可重復性。該流程有效兼顧了制備效率與成功率，單塊薄片平均耗時僅為3小時，提取成功率高達90%。該工作流主要包含以下三大核心步驟：

步驟1：組織目標區(qū)域精準分離（兩種可選方案，圖1a）

精準分離胰島組織（二選一）

酶解法：膠原酶消化胰腺，批量獲取 80–200μm 胰島團；

激光顯微切割：切片后精準截取 100×100μm 目標區(qū)域，適配復雜異質(zhì)性組織。

步驟2：改良無包埋高壓冷凍（HPF），2 分鐘快速去除冷凍填充劑  （圖1b）

傳統(tǒng)方案痛點：冷凍填充劑包裹組織，遮擋目標區(qū)域、后續(xù)修塊步驟繁瑣。

本工作改良方案：

1.以2-甲基戊烷作為冷凍填充劑，將組織直接鋪于電鏡載網(wǎng)（EM grid）完成高壓冷凍；

2.冷凍后將樣品夾具浸入-170℃乙烷-丙烷混合液，僅需2 min即可溶解去除2-甲基戊烷，無需長時間真空升華；

3.殘留培養(yǎng)液/培養(yǎng)基可充當天然保護劑，對操作容錯率更高。

不足：2-甲基戊烷可輕微穿透細胞膜，樣品最表層細胞會出現(xiàn)輕微結(jié)構(gòu)損傷，但組織內(nèi)部細胞超微結(jié)構(gòu)完整，不影響核心觀測。

步驟3：冷凍FIB提?。╨ift-out）超薄薄片制備，自研鉬半載網(wǎng)大幅提升穩(wěn)定性（ 圖1c）

全文創(chuàng)新核心，摒棄傳統(tǒng)夾持機械手，采用低溫探針+再沉積粘接法，同時，搭配實驗室自研鉬材質(zhì)半載網(wǎng)，不僅制定了完整的標準化操作規(guī)范，更大幅提升了薄片（lamella）在提取過程中的機械穩(wěn)定性。

圖1：多細胞冷凍電子斷層掃描樣品制備流程示意圖

三、工作流實測結(jié)果：小鼠胰島原位分子級成像，多項發(fā)現(xiàn)

采用此方法，研究者對小鼠胰島進行冷凍電鏡原位結(jié)構(gòu)觀察，實現(xiàn)了β細胞胰島素晶體的原位分析（圖2）。研究者觀察到三種不同類型的囊泡，分別為棒狀晶體囊泡(圖 2h)，未成熟胰島素晶體囊泡(圖 2i)以及成熟的胰島素晶體囊泡(圖2j)，并對囊泡的數(shù)量與位置分布進行了統(tǒng)計(圖2a，2k)。分析結(jié)果表明成熟的胰島素晶體囊泡占97%，且不同類型的胰島素囊泡分布無明顯特征。而此前使用單細胞體系研究發(fā)現(xiàn)不同成熟狀態(tài)的胰島素囊泡呈現(xiàn)有組織的空間分布，說明了組織等多細胞原位結(jié)構(gòu)研究的必要性

圖2：胰島β細胞的原位結(jié)構(gòu)

通過對此流程所收集的數(shù)據(jù)進行深入分析(圖3)，確定了胰島素的晶胞參數(shù)（圖 3c-f）。其與體外觀察到的六方晶體的結(jié)構(gòu)差異則表明細胞內(nèi)生理條件對晶體堆積的潛在影響。

圖3：胰島素晶體原位晶胞參數(shù)測定（a）胰島β細胞內(nèi)代表性斷層掃描圖像的橫截面。（b）圖(a)中所示的斷層掃描圖像的3D渲染。前位遷移核糖體（青色）和后位遷移的核糖體（黃色）、胰島素囊泡（藍色）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）（橙色）和線粒體（深綠色），通過斷層掃描平均計算確定了核糖體。核糖體在原始位置和取向上進行了映射，通過亞斷層掃描平均計算確定核糖體的位置和取向。（c,e）胰島素晶體晶格結(jié)構(gòu)。(g)從9個斷層圖像中獲得的3795個核糖體在分類和優(yōu)化后形成了兩種不同的構(gòu)象：前移態(tài)（青色）和后移態(tài)（黃色）。(h)兩種構(gòu)象首先與大亞基對齊，僅小亞基以表面模型形式顯示。星號標示了明顯的棘輪結(jié)構(gòu)。(i) 兩種核糖體結(jié)構(gòu)的傅里葉殼相關(guān)曲線在使用0.143作為截止值時，顯示出16 ?的分辨率。

四、總結(jié)

組織樣品前處理是限制cryo-ET走向生物醫(yī)學常規(guī)研究的核心瓶頸。北京大學郭強團隊搭建的模塊化多細胞組織cryo-ET制樣工作流，通過改良無包埋高壓冷凍、優(yōu)化低溫探針提取工藝及配套剛性鉬半載網(wǎng)，在商用設(shè)備體系下實現(xiàn)高效、穩(wěn)定、大視野的組織超薄薄片制備。

研究以胰島β細胞為范例，不僅直觀證明組織原位觀測相比細胞系的獨特生物學信息，更解析原生環(huán)境胰島素晶體結(jié)構(gòu)，為糖尿病相關(guān)分泌機制、各類器官組織原位分子結(jié)構(gòu)研究提供了一套可直接重復的標準化實驗方案，大幅降低了組織冷凍電鏡斷層成像的實驗門檻。

通訊作者介紹：

郭強，現(xiàn)任北京大學生命科學學院研究員，北大-清華生命科學聯(lián)合中心研究員。他專注于原位結(jié)構(gòu)生物學研究，其團隊以冷凍光電聯(lián)用（CLEM）和冷凍電子斷層掃描（cryo-ET）為核心技術(shù)，致力于在近生理條件下對亞細胞結(jié)構(gòu)進行高分辨率三維成像，旨在從“細胞建筑學”（亞細胞結(jié)構(gòu)如何構(gòu)建功能細胞）和“生物大分子社會學”（大分子與細胞器間的相互關(guān)系）兩個層面，揭示生命活動的基本規(guī)律。他曾獲多項重要榮譽，包括2024年北京市杰出青年科學基金、2021年拜耳學者和博雅青年學者等。

文章使用Leica EM ICE多功能高壓冷凍儀可實現(xiàn)200μm厚組織無冰晶玻璃化固定，兼容各類電鏡載網(wǎng)，適配大組織樣品原位冷凍電鏡斷層成像整套實驗流程。

Leica EM ICE高壓冷凍儀

參考文獻：

1.Yichun Wu. Changdong Qin. Wenjing Du. Zhenxi Guo. Liangyi Chen. Qiang Guo. (2023). A practical multicellular sample preparation pipeline broadens the application of in situ cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology .215(3): 107971.