關(guān)于退火，你想知道的“一切”？

凍干工藝分為三個階段：預凍、一次干燥、二次干燥；

“退火”是預凍階段的一個常用操作；

具體的操作方法為：

?  在預凍樣品的過程中，將冷凍完成的樣品加熱到一個高于玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度（Tg’）低于初始融化溫度的條件下；

?  在這個溫度條件下保持一段時間；

?  再次降低溫度，降低到要求的冷凍溫度；

退火有可能對產(chǎn)品產(chǎn)生以下作用：

大冰晶數(shù)量增加，小冰晶數(shù)量減少；

?  晶體比例增加，消除“重結(jié)晶”現(xiàn)象對后續(xù)產(chǎn)品穩(wěn)定性的影響；

?  破瓶現(xiàn)象將會減輕；

?  某些情況下，能夠緩解或者消除結(jié)殼現(xiàn)象；

?  延長了預凍時間；

雖然讀了文章，但回到工作中卻常常是：對著自己產(chǎn)品，還是不知道具體該怎么做；

“高于玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度低于初始融化溫度，把產(chǎn)品放到DSC測一下這兩個參數(shù)，中間的區(qū)間常常有十幾二十度，甚至更寬，那我到底，該選擇哪個溫度？”

“做了退火，產(chǎn)品卻沒有改善，是我的工藝條件設(shè)置的不對么？是溫度不對，還是時間不對呢？”

“退火這個工藝，是否對我的產(chǎn)品不適用呢？”

“其他同類產(chǎn)品的工藝都有退火，那我就也加一個吧，至于對產(chǎn)品有什么影響，并不太清楚；”

等等………..

那么我希望通過今天這個系列的文章，把退火一次講清楚；

知其然、知其所以然，面對任何產(chǎn)品都可以“設(shè)計對應的實驗參數(shù)”；

獲得“合適”的實驗數(shù)據(jù)，以進行評估；

將“退火”這個操作，在自己的產(chǎn)品上運用自如；

預凍過程及完成時，你的樣品的組成：

如對以上內(nèi)容很難理解，可以閱讀以下兩篇：

晶體、無定形物質(zhì)在預凍過程中的物理化學變化（一）

晶體、無定形物質(zhì)的混合物在預凍過程中的物理化學變化（二）

這兩篇的內(nèi)容我覺得對于理解凍干的實際情況非常重要，閱讀量都并不高；

但其實這兩篇是凍干工藝中，很多操作的基礎(chǔ)；

理解本篇內(nèi)容的前提，需要先理解以上兩篇；

知識的積累是層層遞進的，我們的線下課，會帶你一次從0基礎(chǔ)，走到成功放大；

如果閱讀公眾號文章的話，需要一層層按順序?qū)W習；

目前的公眾號，大概寫出了線下課內(nèi)容的30%吧；

層層遞進的關(guān)系沒有理順，基礎(chǔ)沒有理解透徹，后續(xù)的實踐就很容易出現(xiàn)偏差；

退火的本質(zhì)是什么？

操作：在預凍樣品的過程中，將冷凍完成的樣品加熱到一個高于玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度（Tg’）低于初始融化溫度的條件下；

圖一：預凍階段的退火示意圖

?  預凍完成后，形成的結(jié)構(gòu)為：冰晶鑲嵌在非晶態(tài)濃縮溶液中（無定形處方）；

?  預凍溫度低于濃縮溶液的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度，因此濃縮溶液表現(xiàn)為剛性狀態(tài)；

圖二：凍結(jié)過程中冰形成、溶質(zhì)結(jié)晶、共晶點和玻璃化轉(zhuǎn)變的理論相圖。

玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度Tg’，是表達樣品中濃縮溶液流動態(tài)的一個指標；

高于此溫度，則樣品中的濃縮溶液為橡膠態(tài)（具有一定流動能力）；

低于此溫度，則樣品中的濃縮溶液，為剛性狀態(tài)（無法流動）；

?  退火這個步驟，實際是在樣品具有一定流動（但并沒有融化為液體）可能的情況下，給樣品提供一定的能量；

?  這個能量的總量為：熱量乘以持續(xù)時間的一個總數(shù)值；

?  “能夠移動+有能量”在這個條件下，冰晶和非晶態(tài)基質(zhì)有了結(jié)構(gòu)改變的驅(qū)動力和可能性；

基于預凍完成之后，樣品的實際組成情況。結(jié)合，樣品組分在微觀層面的可移動性+退火給予的能量。

從動力學的角度：

根據(jù)Gibbs-Helmholtz的晶體表面能理論：在等溫等壓條件下系統(tǒng)分散度越大，就更加不穩(wěn)定；

具有巨大表面積的系統(tǒng)是熱力學不穩(wěn)定系統(tǒng)；

無論晶體還是非晶態(tài)物質(zhì)，在固定體積的條件下，都將朝著總表面積更小的方向發(fā)展；

表面積自由能較大的：小冰晶、片狀、層狀冰晶，朝著表面積自由能較小的：柱狀、球狀大冰晶方向發(fā)展；

這是退火過程中，晶態(tài)和非晶態(tài)物質(zhì)改變的最根本推動力；

樣品組分在微觀層面的可移動性和退火給予的能量，使得這種改變成為可能；

冰晶和晶體輔料：

退火過程中，冰晶受化學勢驅(qū)動移動和變化；

*粒子總是從高化學勢向低化學勢區(qū)域、相或組元轉(zhuǎn)移；

化學勢與晶體粒子曲率半徑之間的關(guān)系式如下：

曲率半徑小的冰晶有較高的化學勢；

曲率半徑較大和有負曲率半徑的冰晶化學勢較低；

退火過程中，有著較高化學勢的曲率半徑小的冰晶則朝著低化學勢曲率半徑較大的冰晶移動和重組；

圖三：快凍、慢凍兩種預凍條件下，加入退火后，產(chǎn)品內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化

這個過程中，小冰晶生成大冰晶；

未凍結(jié)水和熔融液也發(fā)生重結(jié)晶；

小冰晶、片狀、層狀冰晶朝著柱狀、球狀大冰晶方向發(fā)展；

冰晶尺寸從臨界半徑增大至穩(wěn)定狀態(tài)下的半徑時，重結(jié)晶結(jié)束；

未能完成結(jié)晶的結(jié)晶輔料（如甘露醇），也在此時完成結(jié)晶；

結(jié)晶結(jié)束，退火完成；

這個時間即為在這個板層溫度下，退火需要持續(xù)的時間；

*實驗數(shù)據(jù)顯示，退火溫度越高則需要的退火時間越短，但目前并沒有建立有效的退火溫度和持續(xù)時間之間的數(shù)學公式；

l 非晶態(tài)基質(zhì)（無定形濃縮溶液）

退火過程中，Tp高于Tg’，非晶態(tài)基質(zhì)的粘度隨著溫度的升高而降低；

更低的粘度下，分子間相互運動的摩擦阻力減小；

被非晶態(tài)基質(zhì)包裹的晶態(tài)輔料被釋放，完成結(jié)晶；

被非晶態(tài)基質(zhì)包裹的液態(tài)水被釋放，完成結(jié)晶；

前者常常使得體系的關(guān)鍵溫度提高，從而為一次干燥的產(chǎn)品溫度釋放出空間；

后者使得二次干燥階段需要去除的水分減少，從而使得二次干燥變得更容易；

l 預凍階段溶質(zhì)濃縮和相分離

預凍階段，冰晶從下向上生長或者從左至右、從右至左；

冰晶生長過程中，非晶態(tài)基質(zhì)（濃縮溶液）還具有流動性，因此被冰晶的生長趕向溶液最上層；

形成下面溶質(zhì)少，上層溶質(zhì)多的情況，嚴重時為我們看得見的“結(jié)殼”；

預凍到一次干燥的升溫階段，因為頂部溶質(zhì)富集，熱膨脹被西林瓶壁阻擋，則可能發(fā)生開裂；

退火使得溶質(zhì)分子具有了一定的移動性，持續(xù)一定的時間溶質(zhì)從高濃度向低濃度遷移，從而有可能減緩或消除開裂和結(jié)殼；

退火有可能給產(chǎn)品帶來的變化：

我們還需要知道的（非常重要）：

以上，我以盡量清晰的邏輯，解釋了退火對我們產(chǎn)品的影響；

但理解以上內(nèi)容，還需要附加的一個非常重要的思維是：這些都只是一種可能性；

還有很多的內(nèi)容，因為篇幅的限制，無法展開；

比如退火對于含有晶體輔料的無定形處方Tg’提高的作用，不是增加了這一個步驟，就一定可以提高；

這又和晶體輔料和無定形輔料的配比有關(guān)；

圖四：蔗糖、甘氨酸不同配比處方，退火對Tg’的影響

或者，雖然Tg’有提高，但幅度很小；

圖五：蔗糖、甘露醇不同配比處方，退火對Tg’的影響

而且，退火過程本身也會造成冷凍濃縮液的相分離，從而濃縮液中的蛋白質(zhì)在固液界面處有發(fā)生變性的風險；

退火本身也要消耗時間，如果對產(chǎn)品或者總工藝時長沒有明顯改善，則不要添加此步驟；

總之，這是一個需要通過實驗數(shù)據(jù)去確定是否需要添加的步驟；

而不是所有的凍干工藝都增加“退火”；

最后的話：

?  退火是一個發(fā)生在高于Tg’，低于產(chǎn)品初始融化溫度的溫度區(qū)間的過程；

?  退火的本質(zhì)，是在樣品分子具有一定移動性的前提下，給樣品提供一定的能量；

?  在以上前提下，樣品中的不同組分：從高化學勢向低化學勢的區(qū)域、相轉(zhuǎn)移；

?  退火溫度、退火時間共同影響著提供的能量；

?  退火有很多的優(yōu)點，但并不意味著每個產(chǎn)品的凍干工藝都要加入此步驟；

?  在工藝中是否加入退火，始終需要基于針對你的產(chǎn)品的實驗數(shù)據(jù)；

?  我們需要深入理解凍干工藝中的每一個參數(shù)對產(chǎn)品方方面面所產(chǎn)生的有可能的影響，退火也是同樣；

?  我們需要，讓凍干工藝的每一個參數(shù)都“有據(jù)可依”

特別感謝TELSTAR一直以來提供的中試凍干機，在任何時候都為我提供數(shù)據(jù)和實驗支持；

特別感謝昊擴科技，提供凍干顯微鏡、DSC設(shè)備、實驗人員以及其他財政支持.

參考文獻：

[1] JAMES A. SEARLES,1,2 JOHN F. CARPENTER  Annealing to Optimize the Primary Drying Rate, Reduce Freezing-Induced Drying Rate Heterogeneity, and Determine Tg 0 in Pharmaceutical Lyophilization

[2] Karen E. Beech a , James G. Biddlecombe Insights into the influence of the cooling profile on the reconstitution times of amorphous lyophilized protein formulations  European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 96 （2015） 247-254 JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES, VOL. 90, NO. 7, JULY 2001

[3] M.E. Sahagian, H.D. GOP  Effect of physical freezing rate on the thermal, mechanical and aging properties of the glassy state in frozen sucrose solutions Thermochimica Acta 246 (195 )4) 271-283

[4] Barbara Lueckel,’ David Bodmer,l Bernhard Helk,2 and H. Leuenberge6 Formulations of Sugars with Amino Acids or Mannitol-Influence of Concentration Ratio on the Properties of the Freeze-Concentrate and the Lyophilizate Pharmaceutical Development and Technology, 3(3), 325-336 (1 998)

[5] Wei Wang Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals International Journal of Pharmaceutics 203 (2000) 1–60

文章來源——凍干工藝之家公眾號  •  星德科 TELSTAR 凍干工藝實驗室