活細胞成像 失敗原因與成功訣竅

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■活細胞成像的失敗事例1：細胞衰弱

在活細胞成像期間或結束后查看細胞的情況，經常會發現細胞從中途開始衰弱、細胞死亡、細胞變為意想不到的狀態等現象。導致這些現象的原因可分為以下幾種。

?【原因1】光毒性對細胞造成了損傷

熒光觀察時，激發光的波長越短或光照越強，對細胞造成的損傷也就越大。這就是所謂的“光毒性*1”，不僅會導致細胞因受損而衰弱、死亡，還有可能會造成出乎意料的影響。

對策

·       請盡可能使用靈敏度高的相機

·       請并用增益*2 、Binning*3 等設定，即使較弱的熒光也能感知

·       請盡量調弱激發光

·       進行拍攝設定時也請盡量避免照射激發光

·       請盡可能減少要拍攝的張數

·       不進行拍攝時請切斷激發光

*1：光毒性：通常指照射的光造成的損傷，但是在熒光觀察時，指細胞產生的活性氧使周圍的細胞遭受損傷。

*2：增益：對相機接收的信號進行放大。放大程度越高（調高增益），顯示的畫面越明亮。雖然像素數不會變，但是會產生噪點。

*3：Binning：虛擬地結合周圍的像素，放大單位像素接收的光信號的功能。噪點較調高增益時更少，但是像素數會減少。

?【原因2】沒有穩定供給合適的環境

多數細胞都喜歡與生物體內相同的環境。以人類細胞為例，在培養室及培養用恒溫箱中，基本上都需要滿足溫度37℃、二氧化碳濃度5%、濕度95%以上的條件。如果沒有穩定供給這一條件，細胞就會衰弱，很難獲得準確數據。

對策

·       請使用可以穩定提供適合環境（溫度、二氧化碳濃度、濕度）的培養室及恒溫箱

·       在室溫變化大的季節，請使用空調等保持室溫穩定

·       請避免空調等的風直接吹到樣品。

·       使用多孔培養板時，請使用水分不會蒸發的型號

?【原因3】菌、污染造成的影響

有的細胞容易受容器上附著的菌、污染物的影響。此外，移液管等實驗用器械可能也會導致支原體污染*4、交叉培養污染 *5。

對策

·       實驗時，請確保使用的容器、移液管等周邊用品設備均為無菌狀態

·       請盡量避免攜帶細胞移動

*4：支原體污染：由支原體引起的感染。在細胞株被污染的眾多原因中，是極為普遍的現象之一。

*5：交叉培養污染：正在操作中的細胞混入其他細胞。多為器械原因混入。

■基恩士的熒光顯微成像系統則不會失敗

“高靈敏度黑白制冷CCD相機”

基恩士的一體化熒光顯微成像系統“BZ-X”配備了更適合活細胞成像的高靈敏度制冷CCD相機，以較高的信噪比拍攝被稱為「生物組織光學窗口」的長波長領域內的熒光。同時，也可以很大限度的減輕細胞的損傷和熒光的淬滅，將光毒性對實驗的影響降低。針對于十分重視活細胞培養的iPS細胞的研究，是購買BZ-X較多的案例之一。

*6：生物組織光學窗口：大約在650 nm至900 nm波長區域的熒光叫做生物組織光學窗口。這個區域的光不易被水、血紅蛋白吸收，生物體透過性優異，因此適合于in vivo成像。

切實實現活細胞成像的熒光顯微成像系統

■活細胞成像的失敗事例2：焦點模糊

耗時許久的實驗終于結束，一看得到的數據，卻發現焦點從中途就模糊了。這種現象是較多的失敗事例之一。許多研究者都經歷過這種失敗，但只要理解其中的原因，其實是可以主動避免的。

?【原因1】溫度漂移*7導致細胞移動，設定出錯

如果在接通裝置電源后馬上進行拍攝設定，焦點在設定期間可能就會發生偏移。這是因為接通電源后的一段時間內，容器內的培養液會發生對流，細胞也會移動。觀察設備等也會因溫度變化而出現一定的膨脹現象，使焦點發生偏移。在觀察漂浮細胞、粘附細胞時，都需要注意拍攝設定中與拍攝中的溫度偏差。

對策

·       請在放置細胞前用空容器暖機運行30分鐘，

·       暖機運行后放置細胞，在設定焦點等之前還要等待30至60分鐘

*7：溫度漂移：溫度變化導致漂浮的細胞運動的現象、因裝置自身的膨脹使對焦位置錯開的現象。

?【原因2】分裂時細胞運動

活著的細胞在分裂時尤其會朝上下方向（Z方向）運動。因此，如果在分裂的瞬間用高倍率進行單次自動對焦拍攝，焦點會發生偏移。

對策

·       請使用景深*8大的低倍鏡頭

·       如果是高倍率，請使用自動對焦功能或Z棧功能

在活細胞成像中采取上述預防措施，可切實防止焦點偏移。此時，為了盡量縮短照射激發光的時間，盡量縮小自動對焦及Z棧的設定范圍*9也是非常關鍵的。

*8：景深：表示對焦的范圍。一般NA越高景深越淺。

*9：Z棧的設定范圍：Z棧是對不同的Z位置數據進行多張拍攝的功能。拍攝范圍越大移動步徑越小，可獲得的信息越多，但是細胞的損傷也相應地增加，因此希望以盡可能少的張數進行設定。

■基恩士的熒光顯微成像系統則不會失敗

“焦點追蹤功能”

基恩士的一體化熒光顯微成像系統“BZ-X”，能夠從Z棧拍攝到的數據中自動選擇焦點對得最準的圖像。在下次拍攝時，也能以該圖像為基準，在相同范圍內執行Z棧，可持續在對焦狀態下進行連續拍攝。

不必再為了焦點隨時間發生的錯位、溫度漂移的影響等而大范圍選取Z棧的范圍，可大幅減少一次的拍攝張數。通過縮短激發光照射標本的時間，可抑制光毒性引起的活性降低、熒光淬滅。

無焦點追蹤功能：預測標本的移動、形狀變化，預先設定多余的拍攝范圍

·       單位時間的拍攝時間較長，必須拉長拍攝時間的間隔

·       激發光的照射時間較長，標本因淬滅/損傷而衰弱

有焦點追蹤功能：根據拍攝圖像提取理想對焦點

·       可抑制拍攝張數，也可簡單進行拍攝后的編輯、管理

·       可將激發光的照射控制在非常低的限度，減少標本的淬滅、損傷

切實實現活細胞成像的熒光顯微成像系統

■活細胞成像的失敗事例3：細胞逃離視野

實驗后觀看數據時，有時會發現細胞已經中途移到了視野范圍外。要是細胞在目標現象尚未完成時發生了移動，就只能重做實驗。

?【原因】細胞動了

實驗時間越長，細胞逃離視野范圍的可能性越高。只要細胞是活著的，就無法避免這一問題。相信大家都在各類論文中讀到過觀察細胞細節的數據。其中的絕大多數，都是通過高倍率反復進行多次拍攝后獲得的結果，需要耗費大量的時間和精力。

要切實避免失敗，較好的方法就是一次性拍攝多點，或者是讓視野追隨移動的細胞進行拍攝。

對策

·       請用倍率低的鏡頭拍攝大的視野

·       請一次拍攝多個部位

低倍率觀察時視野較大，細胞不易逃離視野，可切實捕捉細胞。但使用低倍率，卻無法觀察細胞的細節。曝光時間也會變長，如觀察對象在拍攝期間運動，圖像也可能會發生抖動*10，故請注意。

*10：曝光時間和圖像抖動：調弱激發光，曝光時間自然變長。如果在打開快門期間細胞動了，圖像就會抖動。要防止這種現象，使用高靈敏度的相機是一種有效的辦法。

■基恩士的熒光顯微成像系統則不會失敗

“XYZ位置調節功能”

基恩士的一體化熒光顯微成像系統“BZ-X”，即使是在活細胞成像的拍攝過程中，也能對拍攝位置（X、Y、Z）進行調節。這種設計可以避免因細胞移動到視野外，導致實驗失敗的情況。使用已拍攝的圖像調節位置，即使進行高倍率觀察，也能正確地捕捉到細胞。還無需擔心激發光照射引起淬滅、活性降低等現象。

切實實現活細胞成像的熒光顯微成像系統

■使活細胞成像實驗效率大幅提升的方法

一直以來，要獲得更好的研究成果，就必須重復進行更多次的實驗，獲取更多的信息。但是活細胞成像實驗的單次耗時很長，多次重復會耗費大量的時間。特別理想的狀態，就是能夠在單次實驗中獲取盡可能多的信息。

基恩士的一體化熒光顯微成像系統“BZ-X”，能夠解決活細胞成像“單次實驗可獲得的信息量”問題。可一次性獲取2倍、4倍、20倍等不同條件下最多999個點的數據。設定操作也很簡單，可縮短過去用于系統準備及使用者培訓的時間。

■基恩士的熒光顯微成像系統則不會失敗

“多點多條件設定功能”

基恩士的一體化熒光顯微成像系統“BZ-X”，可對設定了多點的每個坐標，分別設定焦點位置、曝光時間、鏡頭倍率、要使用的濾光片、Z棧的幅度/間距等各種條件?？梢淮涡詫嶒灄l件不同的多個標本進行活細胞成像，高效地推動實驗進程。

標本A：集落計數用

鏡頭：相差10倍

觀察方法：相差圖像

圖像拼接：7 × 9張

Z棧：無

曝光時間：1/70 s

標本B：轉染評價用

鏡頭：相差20倍

觀察方法：相差＋熒光疊加

Z棧：1.5 μm間距 8張

曝光時間：相差1/50 s、熒光1/5 s

標本C：培養神經細胞用

鏡頭：油浸60倍

觀察方法：熒光2CH疊加

Z棧：0.5 μm間距 10張

曝光時間：CH1 1/6 s、CH2 1/12 s

基恩士 一體化熒光顯微成像系統 BZ-X1000系列，

在醫學與生命科學等領域應用廣泛。

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