KLF2-BMPER-Smad1/5檢查點調控高流體剪切應力介導的動脈重塑

A KLF2-BMPER-Smad1/5 checkpoint regulates high fluid shear stress-mediated artery remodeling

Keywords: fluid shear stress, vascular remodeling, artery outward remodeling, KLF2, BMPER, Smad1/5, BMP9/10

動脈重塑是一個復雜的過程，涉及結構變化，可以向內重塑以縮小或向外重塑以擴張腔徑。冠狀動脈疾病（CAD）和外周動脈疾病（PAD）中的病理性血管重塑導致組織缺血和疾病癥狀。血管內層的內皮細胞（ECs）持續暴露于血流中，產生一種稱為流體剪切應力（FSS）的摩擦阻力。目前的研究證據支持，EC編碼一個介導動脈重塑穩態的FSS設定值。動脈血流增加或減少分別刺激向外或向內重塑。根據這一觀點，低FSS刺激內向重塑，生理FSS穩定血管以抑制重塑，高于生理的FSS促進外向重塑。

骨形態發生蛋白（BMPs）是血管發育、完整性、炎癥反應和胰島素敏感性的重要調控因子。BMP結合內皮調節因子（BMPER）是一種主要表達于ECs中的分泌蛋白，能結合BMPs和BMP受體，調節內皮細胞及可能鄰近平滑肌細胞中的BMP信號。BMPER在血管生成、動脈粥樣硬化、炎癥和糖尿病等疾病相關血管過程中發揮重要作用。

美國耶魯大學心血管研究中心、貝勒醫學院心血管研究科及英國牛津大學發育與再生醫學研究所團隊曾在報告中指出，低FSS激活Smad2/3，誘導動脈內向重塑。其后續的研究旨在闡明高血流量誘導的動脈外向重塑的機制。結果發現，Klf2表達升高會誘導BMPER終止Smad1/5激活，從而解除Akt的抑制允許重塑，還表明人為阻斷Smad1/5能有效挽救1型糖尿病（T1D）和2型糖尿病（T2D）小鼠的不良重塑。因此，闡明動脈外向重塑的關鍵機制暗示了治療缺血性疾病的潛在方法。研究成果發表于 Nature Cardiovascular Research 期刊題為“A KLF2-BMPER-Smad1/5 checkpoint regulates high fluid shear stress-mediated artery remodeling”。

以往研究發現，Smad1/5在生理FSS時被zuidachengdu激活，在高（即超生理水平）FSS時被抑制。KLF2及其近同源Klf4是FSS誘導的主要EC轉錄因子。因此，研究測試了高FSS下Klf2在Smad1/5抑制中的作用。HUVECs先用對照組（siCtrl）和KLF2（siKLF2）siRNA處理，然后暴露于FSS 以3 dynes/cm/2 （低）、12 dynes/cm/2 （生理）或40 dynes/cm/2（高）的幅度處理12小時，檢測Smad1核易位作為其激活標志。在對照組細胞中，核Smad1在生理剪切應力時zuidachengdu進入細胞核，隨后在高FSS時受到抑制；在KLF2敲低（KD）細胞中，核Smad1在低FSS和生理FSS下與對照組相似，但在高FSS下仍在細胞核內（圖1 a-b）。通過免疫染色和蛋白質印跡法測定Smad1/5磷酸化顯示的結果相似（圖1 c-f）。因此，在高FSS下KLF2是抑制Smad1激活的必要條件。

隨后，在有無KLF2 KD的HUVECs上進行了RNAseq，重點關注與BMP通路相關且在KLF2 KD后下降的基因。結果觀察到，BMPER在高流量時表現出Klf2依賴性的誘導。數據表明，BMPER很可能是ECs中Klf2/4的直接靶基因。

為測試其功能，HUVECs被轉染對照（siCtrl）或BMPER（siBMPER）siRNA，然后在FSS中以3、12和40 dynes/cm2 處理12小時。與KLF2 KD類似，BMPER KD在低FSS或生理FSS下效果有限，但在高FSS下有效阻斷Smad1核易位和磷酸化的減少。這些結果表明，高FSS抑制Smad1/5需要KLF2依賴性的BMPER誘導。

圖1    KLF2介導高FSS誘導的Smad1/5抑制。

進一步地，為了在體內研究高FSS，構建了一個動靜脈瘺（AVF）模型，其中右頸動脈（RCA）與外頸靜脈相連（圖2 a），導致兩側血流量較大。與對照LCA相比，手術后的RCA周長在第3天顯著增加，14天時又進一步增加（圖2 b-c）。這些結果顯示手術后有強烈的外向重塑。目前尚無適合針對Klf2的抗體，但其共調控同源物Klf4的染色顯示，RCA顯著高于LCA，支持手術后RCA的剪切應力升高。BMPER免疫染色在近端RCA中顯著增加，而LCA中表達幾乎檢測不到（圖2 d-e）。相比之下，近端RCA的Smad1/5磷酸化較低，這與高剪切時的下降相符（圖2 f-g）。這些結果表明，在高FSS條件下BMPER的誘導與動脈外向重塑過程中Smad1/5失活相關。

據報道，Smad1/5通路抑制VEGFR2和Akt的激活，表明Smad1/5在生理FSS下抑制VEGFR2和Akt，以穩定血管并防止不必要的血管重塑。然而，在高FSS下抑制Smad1/5會釋放該抑制，從而實現外部重塑。這一假設預測，在高FSS動脈中，抑制BMPER可能會提升Smad1/5，降低Akt活性。隨后，研究人員確認Akt被高FSS激活。為測試BMPER對高FSS下Akt激活的影響，使用對照組（siCtrl）或BMPER（siBMPER）siRNA處理的HUVECs在40 dynes/cm2下進行FSS，發現 BMPER KD降低了高FSS下的Akt激活。因此，在高FSS條件下的BMPER誘導有助于Akt激活。

為研究BMPER在體內的效果，生成內皮特異性BMPER敲除小鼠（BMPER iECKO），使用后肢缺血（HLI）模型測試了BMPER的作用，發現BMPER ECKO嚴重損害了血流恢復速度。對組織切片進行SMA染色以識別肌肉動脈，觀察到WT小鼠中，平行于結扎的大腿組織比未手術的大腿組織有更高的肌肉動脈密度，表明動脈生成。在BMPER ECKO小鼠組織中，結扎的大腿肌肉動脈與對照組相比沒有增加。對照組與BMPER iECKO小鼠也接受了AVF手術。術后第3天，近吻合口近端RCA或對照LCA相似位置的連續剖面顯示，BMPER ECKO損害了外向重塑。對照組近端RCA誘導了BMPER表達，但在BMPER iECKO小鼠中未實現。對照組近端RCA的Smad1/5活化被抑制，但在BMPER iECKO小鼠中仍保持較高。這些數據共同提供了體內證據，表明BMPER上調抑制了Smad1/5，從而允許動脈向外重塑。

圖2    高FSS介導的外重塑AVF模型。

FSS激活Smad1/5需要可溶性BMP9和10的存在，分別是由肝細胞和心肌細胞產生的循環因子。因此，用 BMP9/10阻斷抗體（bAbs）阻止Smad1/5 的激活。BMPER iECKO和對照小鼠接受HLI治療后，每周一次腹腔注射對照IgG或BMP9/10 bAbs（圖3 a）。BMP9/10 b Abs有效逆轉BMPER iECKO后血流恢復不良（圖3 b-c），動脈化也有相應改善（圖3 d-e）。BMP9/10 bAbs還恢復了HLI模型中BMPER iECKO小鼠血管新生因子Vegfa和Pdgfb的表達。這些結果證實，BMPER通過BMP-Smad1/5通路起作用。

此外，為探討BMP9/10b Abs是否能改善T1D患者的血流恢復速度，在C57BL/6小鼠中采用了鏈脲佐菌素（STZ）模型。確診高血糖的小鼠接受HLI手術后注射對照IgG或BMP9/10 bAbs，發現 BMP9/10 bAbs顯著改善了血流恢復速度，及大腿動脈化，小腿血管生成略有增加。這些結果表明，BMP9/10阻斷Abs在缺血性疾病中抑制Smad1/5通路具有治療潛力。

同時，在喂食高脂飲食誘導的T2D模型中，如預期，T2D小鼠的HLI恢復率顯著降低，雌鼠的抑制更強。但BMP9/10 bAbs顯著改善了雄性和雌性小鼠的血流恢復速度，及大腿動脈化，并適度增加小腿血管生成。在BMP9/10 bAbs處理后，Akt活化和BMPER表達也恢復了。這些結果表明，抑制Smad1/5通路為改善缺血性疾病的穩態重塑提供了一種手段。

圖3    BMP9/10阻斷抗體 Abs 恢復BMPER iECKO HLI模型中的血流速度。

總之，該研究報告了高FSS通過提高KLF2抑制Smad1/5，KLF2誘導BMP通路抑制劑BMPER，從而去抑制Akt。在小鼠中，手術誘導的高FSS使BMPER表達升高，Smad1/5失活，并誘導血管外向重塑。內皮BMPER缺失損害了血流恢復速度和血管重塑。用BMP9/10阻斷抗體阻斷EC Smad1/5活化，改善了1型和2型糖尿病小鼠模型中的血管重塑。因此，抑制Smad1/5是治療缺血性疾病的潛在方法。

參考文獻：Deng H, Zhang J, Wang Y, Joshi D, Pi X, De Val S, Schwartz MA. A KLF2-BMPER-Smad1/5 checkpoint regulates high fluid shear stress-mediated artery remodeling. Nat Cardiovasc Res. 2024 Jul;3(7):785-798. doi: 10.1038/s44161-024-00496-y. Epub 2024 Jul 8. PMID: 39196179; PMCID: PMC12306366.

原文鏈接：pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39196179/

Journal Impact Factor: 10.8 (2024)

ISSN 2731-0590 (online)

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