小鼠乳腺上皮細胞比一般成纖維細胞難養(yǎng)、嬌氣很多，核心問題就是：容易分化、容易長雜細胞、容易不貼壁、容易凋亡。下面按培養(yǎng)全流程給你整理最關鍵的注意事項，直接照著避坑就行。

一、原代分離階段（最容易翻車）

1、取材時間很關鍵

優(yōu)先用泌乳期（產后 3～7 天）小鼠，乳腺上皮含量、活力。

處女鼠或退化期乳腺，上皮比例低、成纖維多，很難純。

2、一定要去除脂肪和結締組織

乳腺脂肪多，消化后油脂會裹住細胞，導致不貼壁、大量死亡。

盡量肉眼剔除脂肪，消化后用去脂步驟（低速離心棄上層油脂）。

3、消化強度要溫和

只用膠原酶 Ⅳ + 胰酶/分散酶聯合消化，不要單用強胰酶。

消化時間寧短勿長，過度消化會直接導致細胞不貼壁。

4、紅細胞與成纖維必須處理

用紅細胞裂解液短時間處理。

差速貼壁（先讓成纖維貼壁 30～60min，再轉移上清）能顯著提高純度。

二、培養(yǎng)基與添加劑（決定能不能養(yǎng)好）

不要用普通 DMEM 高糖硬養(yǎng)

原代乳腺上皮建議用上皮專用培養(yǎng)基：

DMEM/F12 基礎

添加：胰島素、氫化可的松、EGF、轉鐵蛋白等

缺少生長因子會迅速分化、停止增殖。

血清選擇

胎牛血清優(yōu)于新生牛血清，濃度一般 5%～10%。

血清過高反而促進成纖維生長，壓低上皮。

避免頻繁更換不同的培養(yǎng)基

細胞適應后突然換液配方，容易大片飄起、皺縮。

三、貼壁與底物（上皮細胞特別挑 “床”）

1、強烈建議包被

用鼠尾膠原 I、纖連蛋白、明膠包被培養(yǎng)瓶/皿。

不包被：原代細胞基本不貼壁或貼壁很弱，一吹打就掉。

2、接種密度不能太低

乳腺上皮是社群依賴性強的細胞。

密度太低會：不增殖、凋亡、成纖維反超。

建議較高密度接種。

四、培養(yǎng)環(huán)境與操作

1、溫度與 pH 穩(wěn)定

37℃、5% CO?，嚴格控溫。

拿離培養(yǎng)箱時間盡量短，否則細胞迅速變圓、脫落。

2、換液輕柔

不要直接對著細胞沖液。

原代前 3 天只半量換液，不要全量，減少刺激。

3、吹打輕柔，避免氣泡

氣泡會導致上皮細胞膜破裂、大量死亡。

吹打用細口吸管，輕輕吹打至分散即可，不要劇烈。

五、傳代注意事項

1、不要等太滿再傳

匯合度 70%～80% 就傳，超過 90% 容易分化、接觸抑制。

2、胰酶消化時間嚴格控制

鏡下觀察：細胞間隙變大、開始變圓就終止。

過度消化會導致傳代后不貼壁。

3、傳代比例

一般 1:2～1:3，不要過度稀釋。

六、常見問題與防控（重中之重）

1、成纖維細胞污染

表現：出現長梭形細胞，快速瘋長，擠壓上皮。

處理：差速貼壁、使用上皮選擇性培養(yǎng)基、輕柔刮除成纖維區(qū)域。

2、細胞不貼壁/大量漂浮

原因：消化過度、底物未包被、接種密度太低、油脂過多。

解決：膠原包被、提高密度、縮短消化時間。

3、細胞形態(tài)變差、空泡多、不增殖

多為分化或老化，原代細胞一般只能傳 1～3 代。

激素（催乳素 + 地塞米松）會誘導泌乳分化，增殖會變慢。

4、支原體污染

乳腺原代非常容易染支原體，導致生長緩慢、形態(tài)異常。

建議新分離細胞立即做支原體檢測。

七、凍存與復蘇

凍存液：90% 血清 + 10% DMSO，或專用上皮細胞凍存液。

復蘇快速融化，盡快離心去除 DMSO，減少毒性。

復蘇前一天提前包被培養(yǎng)瓶。

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