摘要：慢病毒包裝過程中，包裝細(xì)胞表面共表達(dá)的CAR蛋白可被動摻入病毒包膜，形成攜帶"表面CAR"的病毒顆粒，進(jìn)而通過CAR-抗原相互作用介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞脫靶轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘發(fā)CAR耐藥性腫瘤克隆。近期研究基于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留策略開發(fā)了CLEAN-V平臺，系統(tǒng)解析了該機(jī)制并提供了可行解決方案。

研究伊始，研究者首先對慢病毒包裝體系中CAR蛋白的膜定位及其病毒摻入現(xiàn)象進(jìn)行了確證。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，在HEK293T包裝細(xì)胞轉(zhuǎn)染CAR編碼質(zhì)粒后，CAR蛋白以完整形式大量表達(dá)于包裝細(xì)胞表面，而非僅滯留于胞內(nèi)。這一表面定位特征為其后續(xù)被動摻入病毒包膜提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。為進(jìn)一步驗證病毒顆粒中是否攜帶CAR蛋白，研究者采用ELISA法對三種不同CAR結(jié)構(gòu)的慢病毒上清進(jìn)行檢測，結(jié)果均明確檢測到CAR蛋白的存在。上述實驗共同確認(rèn)，在常規(guī)慢病毒包裝過程中，CAR蛋白不僅表達(dá)于包裝細(xì)胞膜表面，而且確實被物理性地包裹進(jìn)病毒包膜，形成"表面CAR"修飾的病毒顆粒。該現(xiàn)象不依賴于CAR的抗原識別區(qū)序列，具有普遍性，提示這可能是CAR慢病毒生產(chǎn)中的一個系統(tǒng)性風(fēng)險因素。

為回答這一關(guān)鍵問題，研究者設(shè)計了基于包膜糖蛋白突變體的功能驗證實驗。他們分別采用野生型VSV-G和攜帶K47Q、R354Q雙點(diǎn)突變的VSV-G突變體（簡稱VSVGmut）對同一抗CD19 CAR慢病毒進(jìn)行假型化包裝。實驗結(jié)果顯示，VSVGmut假型病毒在CD19陰性的HEK293T細(xì)胞上幾乎喪失了轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，說明突變型VSV-G確實顯著削弱了經(jīng)典的受體介導(dǎo)進(jìn)入途徑。然而，令人意外的是，該VSVGmut病毒在CD19陽性的Raji腫瘤細(xì)胞上仍保留了相當(dāng)可觀的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。這一矛盾結(jié)果強(qiáng)烈提示，病毒顆粒的進(jìn)入不依賴于VSV-G功能，而是借助了其他表面分子。

為進(jìn)一步驗證該"其他分子"是否即為被動摻入的CAR蛋白，研究者開展了競爭性蛋白阻斷實驗。向培養(yǎng)體系中加入可溶性CD19蛋白后，VSVGmut病毒對Raji細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)幾乎被抑制。由于可溶性CD19僅能競爭性結(jié)合病毒表面的CAR分子，而不影響VSV-G介導(dǎo)的途徑，該結(jié)果明確證明：包裝過程中整合到病毒包膜表面的CAR蛋白具有功能活性，能夠主動識別腫瘤細(xì)胞表面的CD19抗原，并介導(dǎo)病毒顆粒的脫靶進(jìn)入。這一發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性地揭示了"表面CAR"介導(dǎo)的脫靶轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，并指出其可能誘發(fā)腫瘤細(xì)胞獲得CAR基因整合，進(jìn)而在治療壓力下產(chǎn)生耐藥性克隆。

在明確了上述風(fēng)險機(jī)制后，研究者將策略重心轉(zhuǎn)向了源頭控制——即在翻譯后水平阻止CAR蛋白抵達(dá)細(xì)胞膜。他們設(shè)計了基于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）滯留信號的蛋白質(zhì)表達(dá)阻斷劑（PEBL）系統(tǒng)。具體而言，研究者構(gòu)建了四種融合蛋白：將CD19蛋白或抗FMC63 scFv片段分別與兩種不同的ER滯留信號（PEBL-A和PEBL-B）融合，形成"誘餌"分子，以期在ER內(nèi)捕獲新合成的CAR蛋白，使其無法繼續(xù)沿分泌通路向膜表面運(yùn)輸。

將上述PEBL構(gòu)建體與CAR編碼質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明：基于scFv的PEBL（尤其是Anti-FMC63 scFv-PEBL-A和-PEBL-B）能夠高效阻斷CAR向細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)運(yùn)，而基于CD19蛋白的PEBL則阻斷效率有限。這一差異提示，scFv誘餌通過直接識別CAR的胞外scFv區(qū)域，其結(jié)合親和力與特異性優(yōu)于天然配體（CD19）介導(dǎo)的捕獲機(jī)制。在長達(dá)72小時的動態(tài)觀察中，CAR表面表達(dá)始終被顯著抑制，其中PEBL-A信號展現(xiàn)出更持久、更穩(wěn)定的阻斷活性。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)CAR阻斷效率與PEBL質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染劑量呈明確的正相關(guān)關(guān)系，提示該策略具備劑量可調(diào)性的優(yōu)勢。

驗證了PEBL的單體有效性后，研究團(tuán)隊著手將其無縫嵌入第三代慢病毒四質(zhì)粒包裝系統(tǒng)（含Gag/Pol、Rev、VSV-G和轉(zhuǎn)移載體）。首先，他們利用T2A自裂解肽實現(xiàn)PEBL與VSV-G的共表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PEBL置于VSV-G上游（PEBL-2A-VSVG）時阻斷效果優(yōu)于反向排列，提示PEBL的翻譯順序可能影響其正確折疊與功能發(fā)揮。

然而，當(dāng)將該策略延伸至Gag/Pol和Rev質(zhì)粒時，修飾后的Gag/Pol構(gòu)建體未顯示出任何阻斷活性，而Rev-P2A-PEBL僅產(chǎn)生中等程度的阻斷效果。研究者推測，相鄰病毒基因的順式調(diào)控元件或轉(zhuǎn)錄干擾可能影響了PEBL的轉(zhuǎn)錄水平。因此，他們在質(zhì)粒中額外引入獨(dú)立的EF1α啟動子以驅(qū)動PEBL表達(dá)。改進(jìn)后的結(jié)果顯示，Gag/Pol-EF1a-PEBL依然無效，但Rev-EF1a-PEBL的阻斷效率得到顯著提升，說明Rev質(zhì)粒骨架對PEBL表達(dá)具有更好的兼容性。

值得注意的是，研究團(tuán)隊還嘗試通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)PEBL的HEK293T細(xì)胞系，并成功獲得兩個單克隆（2G6和2D11），但后續(xù)CAR阻斷實驗顯示其下調(diào)能力非常有限。該結(jié)果表明，穩(wěn)定細(xì)胞系中PEBL的表達(dá)水平不足以實現(xiàn)高效阻斷，瞬時高表達(dá)策略在目前條件下更具可行性。

基于上述優(yōu)化結(jié)果，研究者構(gòu)建了四質(zhì)粒CLEAN-V系統(tǒng)，即將PEBL工程化的VSV-G和Rev質(zhì)粒，與CAR轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和Gag/Pol輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。通過比較不同質(zhì)粒組合的阻斷效果，他們發(fā)現(xiàn)：單獨(dú)使用PEBL-VSVG或REV-PEBL時，均可實現(xiàn)中等程度的CAR阻斷；而兩者聯(lián)合使用時（VSVG/REV-PEBL），CAR表面表達(dá)降至低水平，阻斷效率達(dá)到峰值。

進(jìn)一步通過ELISA檢測病毒上清中的CAR蛋白含量，發(fā)現(xiàn)含PEBL的病毒組其CAR蛋白水平顯著低于對照組。在VSVGmut系統(tǒng)中，VSVGmut/REV-PEBL組合同樣展現(xiàn)出高效的CAR清除能力，最終病毒產(chǎn)物中殘留CAR蛋白幾乎無法檢出。雖然CLEAN-V的病毒物理滴度相比對照組下降了約50%，但其對腫瘤細(xì)胞的CAR介導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)能力幾乎被消除。這一結(jié)果明確表明，四質(zhì)粒系統(tǒng)能夠成功生產(chǎn)出表面無CAR污染的"CAR-less"慢病毒載體，在犧牲部分產(chǎn)量的前提下?lián)Q取了顯著提升的安全性窗口。

為降低對現(xiàn)有包裝質(zhì)粒改造的依賴，研究團(tuán)隊進(jìn)一步探索了五質(zhì)粒系統(tǒng)——即引入第五個獨(dú)立的PEBL表達(dá)質(zhì)粒（PEBLx5），由CMV啟動子驅(qū)動抗FMC63 scFv-PEBL融合蛋白的表達(dá)，而無需對VSV-G和Rev質(zhì)粒進(jìn)行任何基因工程改造。初步實驗證實該獨(dú)立質(zhì)粒能有效阻斷CAR表面表達(dá)。

然而，由于額外質(zhì)粒的引入可能稀釋核心包裝組分的轉(zhuǎn)染效率，研究者對PEBLx5的用量進(jìn)行了精細(xì)滴定。結(jié)果顯示，增加PEBLx5劑量可逐步增強(qiáng)CAR阻斷效果，但同時導(dǎo)致病毒滴度呈劑量依賴性下降。為在阻斷效率與病毒產(chǎn)量之間取得最佳平衡，研究者選定0.27 μg PEBLx5作為后續(xù)實驗的優(yōu)化劑量。在VSVGmut五質(zhì)粒系統(tǒng)中，CLEAN-V同樣表現(xiàn)出穩(wěn)健的CAR阻斷能力，最終病毒產(chǎn)物中CAR蛋白殘留幾乎無法檢出，且對腫瘤細(xì)胞的非VSV-G依賴性轉(zhuǎn)導(dǎo)能力喪失。由此可見，五質(zhì)粒系統(tǒng)同樣適用于CLEAN-V生產(chǎn)，但需要在質(zhì)粒劑量配比上進(jìn)行更嚴(yán)格的預(yù)優(yōu)化。

在確證CLEAN-V可有效防止CAR介導(dǎo)的脫靶轉(zhuǎn)導(dǎo)后，研究者對最終產(chǎn)物——即CLEAN-V所生成CAR-T細(xì)胞的功能完整性進(jìn)行了評估。分別采用四質(zhì)粒和五質(zhì)粒系統(tǒng)生產(chǎn)的CLEAN-V轉(zhuǎn)導(dǎo)原代人類T細(xì)胞，結(jié)果顯示CLEAN-V組與傳統(tǒng)慢病毒載體組所生成的CAR-T細(xì)胞表達(dá)了等水平的CAR蛋白，且表達(dá)動力學(xué)高度一致。

在長期培養(yǎng)過程中，各組CAR陽性細(xì)胞比例維持良好，但值得注意的是，五質(zhì)粒系統(tǒng)CLEAN-V的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率略低于四質(zhì)粒系統(tǒng)和傳統(tǒng)病毒組。然而，各組T細(xì)胞的增殖動力學(xué)、表面標(biāo)志物（CD4、CD8、CD45RA、CD62L、CD69）表達(dá)譜均無顯著差異。基于CD45RA和CD62L的亞群分析進(jìn)一步表明，初始、效應(yīng)和記憶T細(xì)胞的組成比例在組間保持高度一致。

在體外功能實驗中，CLEAN-V來源的CAR-T細(xì)胞對Raji靶細(xì)胞展現(xiàn)出與傳統(tǒng)載體組相當(dāng)?shù)牧呀饣钚裕曳置诘腡NF-α、IL-2和IFN-γ水平無明顯差異。這些數(shù)據(jù)共同證明，CLEAN-V平臺在消除脫靶風(fēng)險的同時，保留了CAR-T細(xì)胞的表型完整性和抗腫瘤效應(yīng)功能，未引入任何可檢測的功能缺陷。

綜上，CLEAN-V平臺通過在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)層面"錨定"CAR蛋白，在翻譯后水平有效阻斷了其向包裝細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而從源頭上切斷了病毒包膜CAR污染的途徑。該策略既不涉及基因組編輯的不可逆改變，也不干擾病毒RNA基因組的包裝與遞送，是一種兼具安全性與可操作性的工程化解決方案。未來，若開發(fā)出靶向通用型G4S接頭的PEBL分子，或?qū)⑹乖撈脚_拓展至任意CAR構(gòu)建體，實現(xiàn)"一攬子"適配，為體內(nèi)CAR-T療法的臨床轉(zhuǎn)化提供更加穩(wěn)健的病毒載體安全保障。在相關(guān)的腫瘤組織表征與免疫組化分析中，斯達(dá)特提供的FMC63 Recombinant Rabbit mAb (S-2163-77)可作為一種可靠的檢測工具，輔助研究者對腫瘤靶細(xì)胞的CK-Pan表達(dá)進(jìn)行多參數(shù)評估。

產(chǎn)品信息

杭州斯達(dá)特是優(yōu)寧維旗下品牌，志在為全球生命科學(xué)行業(yè)提供優(yōu)質(zhì)的抗體、蛋白、試劑盒等產(chǎn)品及研發(fā)服務(wù)。依托多個開發(fā)平臺：重組兔單抗、重組鼠單抗、快速鼠單抗、重組蛋白開發(fā)平臺（E.coli,CHO,HEK293,InsectCells）、一步法ELISA平臺，PTM泛修飾抗體平臺。

體內(nèi)CAR-T療法中包裝細(xì)胞共表達(dá)CAR蛋白的難題何解？