光學成像目前是應用比較廣泛的技術，尤其適合在細胞和分子水平進行研究。主要分為生物發光和熒光成像兩類以及其他體內成像。

活體成像技術的應用范圍非常廣，研究對象也多種多樣：

1、模型動物：如小鼠、大鼠、斑馬魚等，是疾病模型和藥物篩選中常見的對象。

2、植物：如擬南芥、煙草等，用于植物研究在干旱、鹽脅迫等條件下的生理反應和病原侵染過程。

3、細胞和組織：雖然不全是"活體"，但離體的組織活細胞樣本也可以用類似技術進行成像分析。

根據研究目的，活體成像可以檢測不同的生物學實驗：

1、基因表達與蛋白激活：觀察特定基因在何時何地被激活。

2、細胞行為：追蹤細胞的遷移、增殖、凋亡和分布。

3、疾病進展：監測腫瘤的生長與轉移、炎癥感染灶的擴散等。

4、藥物響應：評估藥物或治療方案的效果，通過縱向觀察一只動物，減少個體差異。

無論采用哪種技術，活體成像的核心價值在于能夠在不傷害動物的前提下，對同一個體進行長期、動態的觀測，從而將看不見的生命過程轉化為可視化的數據。

1、腫瘤研究：實時監測腫瘤細胞的增殖、轉移和藥物響應。

2、藥物研發：追蹤藥物在體內的分布、代謝過程及靶向效果。

3、感染與免疫：觀察細菌或病毒在體內的擴散，以及免疫細胞的遷移和應答。

4、基因表達分析：研究特定基因在何時、何地被激活。

1、追求高靈敏度和定量：選生物發光（BLI），背景干凈，信號穩定，適合長期監測。

2、需要多靶點或高分辨率：選熒光成像（FLI），標記靈活，可多色成像，能看清結構細節。

3、要看精細解剖結構：選 MRI或CT，能清晰呈現器官和組織形態。

D-熒光素（D-Luciferin）是螢火蟲熒光素酶（Firefly Luciferase）系統的專用底物，也是目前活體成像中比較主流的選擇。

它發出的光波長在540-600nm，屬于偏紅光，在生物組織中的穿透性較好，信噪比較高。信號穩定，特異性好，適合用于腫瘤生長、藥物療效評估等需要長期動態監測的實驗。

大多數基于Luc報告基因的活體成像實驗，如腫瘤模型、干細胞示蹤、感染性疾病研究等。

除了D-熒光素，根據你使用的熒光素酶不同，還有其他選擇。

這是海腎熒光素酶（Renilla Luciferase）的底物。它的發光波長較短（460-540nm），在體內代謝快，信號持續時間短，通常用于雙報告基因實驗或 BRET 研究。

這是一種新型底物，與 NanoLuc 熒光素酶聯用。它的亮度較高，信號持續時間較長，靈敏度優于傳統底物，適合用于檢測低豐度靶點或需要高靈敏度的場景。

配制D-熒光素溶液時，建議用不含鈣鎂離子的 PBS（如 DPBS），因為這些離子可能會抑制熒光素酶的活性。

腹腔注射底物后，通常需要等待10-15分鐘讓信號達到峰值平臺期再進行成像。整個穩定發光窗口大約持續30-45分鐘，要合理安排操作時間。

在進行昂貴的動物實驗前，建議先在體外驗證你的細胞是否穩定表達熒光素酶，并確認發光強度與細胞數量呈良好的線性關系，這能避免后續實驗走彎路。

你的細胞/動物表達什么酶，就選對應的底物，這是基本原則。

追求高靈敏度可考慮 NanoLuc/Furimazine 系統；常規腫瘤、干細胞追蹤用經典的 Firefly Luc/D-熒光素系統已經足夠。

體內實驗可優先考慮 D-熒光素鉀鹽，溶解方便，性能穩定。

可以直接用D-熒光素鉀鹽，這是比較穩妥、通用的選擇。

根據你使用的熒光素酶（如Renilla或NanoLuc）選擇對應的腔腸素或Furimazine。

無論選哪種，都建議在正式實驗前做預實驗，確定合適的底物濃度和成像時間點。

優先選擇近紅外 NIR-I（700–900 nm）和 NIR-II（900–1700 nm）波段，避開可見光（藍/綠/紅），因為后者在皮下/體內的穿透能力較弱。

小鼠皮膚、血液、內臟在 500–650 nm 波段的自身熒光較強，建議少用綠色和橙色熒光染料。

要求染料低毒性、不易代謝猝滅、無免疫原性，同時適配靜脈、腹腔或局部給藥等不同途徑。

綠色（FITC、Calcein、GFP）：僅適用于體表淺層成像，體內易被血紅蛋白吸收，深部組織較難觀測。

紅色（Cy5、Cy5.5）：淺層可用，但在腹部和胸腔成像時背景信號較高。

體內成像的常用波段，穿透深、儀器通用。

Ex/Em：780/810 nm

優點：臨床獲批、體內毒性較低，是血管/淋巴/腫瘤示蹤的常用選擇。

用途：活體血管成像、淋巴引流、腫瘤富集、臟器灌注。 缺點：光穩定性一般，易快速代謝。

Ex/Em：750/780 nm（Cy7）、788/820 nm（Cy7.5）

優點：熒光亮度較高、修飾方便，可標記蛋白/多肽/藥物。

用途：活體靶向腫瘤成像、藥物體內示蹤、細胞活體示蹤。

Ex/Em：750/780 nm

用途：活體干細胞/免疫細胞的體內追蹤，標記活細胞并觀察其體內遷徙與定植。

穿透較深、背景較低，適合深部腫瘤、腦部和內臟成像。

代表染料：IR-1061、H?O? 探針、NIR-II 量子點

優勢：皮下 >5 mm 組織可清晰成像，動物自發熒光干擾較少。

適用：深部實體瘤、腦部原位瘤、深層臟器示蹤。

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部分插圖來源：小紅書號262802942、小紅書號2588520423