傳代培養(yǎng)的主要操作步驟

來源：上海莼試生物技術(shù)有限公司 2026年07月28日 09:01

細(xì)胞傳代培養(yǎng)是指當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞增殖至接觸抑制、營(yíng)養(yǎng)耗竭時(shí)，將其分散后按比例轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)容器中，繼續(xù)維持生長(zhǎng)擴(kuò)增的技術(shù)，也叫繼代培養(yǎng)，是細(xì)胞培養(yǎng)中基礎(chǔ)的常規(guī)操作之一。

分類：

‌貼壁細(xì)胞傳代‌：采用酶消化法，常用0.25%胰蛋白酶-EDTA混合液處理，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁脫落。

‌懸浮細(xì)胞傳代‌：可直接采用離心法，1000rpm離心3-5分鐘后重懸分裝，也可直接吸棄部分上清后吹打傳代。

‌半懸浮細(xì)胞傳代‌：貼壁不牢固，可直接吹打使細(xì)胞脫落完成傳代。

細(xì)胞傳代培養(yǎng)操作步驟如下：

（1）傳代前在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)密度，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80%~90%時(shí)，即可進(jìn)行傳代。

（2）吸掉或倒掉培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液。加入PBS清洗1~2次，左右輕輕搖晃后棄掉。

（3）根據(jù)培養(yǎng)瓶大小向瓶?jī)?nèi)加入適量含EDTA的，一般應(yīng)覆蓋整個(gè)培養(yǎng)瓶底。

（4）把培養(yǎng)瓶放入37℃ CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行消化，2~5min后拿出放在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)有70%~80%細(xì)胞收縮變圓、細(xì)胞間隙變大時(shí)，再輕輕拍打培養(yǎng)瓶使剩余細(xì)胞脫落，然后立即加入2倍量的培養(yǎng)液中止消化，使用吸頭輕輕吹打，混合均勻，以防消化過度。

（5）吸出所有細(xì)胞懸液至離心管內(nèi)，1000rpm/min離心3~5min。

（6）棄上清，加入適量培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，輕輕吹打混勻，使細(xì)胞均勻分散。

（7）用吸頭吸取適量細(xì)胞懸液，以適宜的密度接種于新的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)液，搖勻，放置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

（8）根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)確定換液或傳代時(shí)間，甚至進(jìn)行細(xì)胞凍存。

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