手機(jī)版
化工儀器網(wǎng)手機(jī)版
化工儀器網(wǎng)小程序
官方微信
公眾號(hào)：chem17
掃碼關(guān)注視頻號(hào)
高內(nèi)涵篩選實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的核心：原理、參數(shù)優(yōu)化與數(shù)據(jù)分析流程
一、高內(nèi)涵篩選底層工作原理
高內(nèi)涵篩選（HCS）依托自動(dòng)化顯微成像與定量圖像解析技術(shù)，突破傳統(tǒng)單讀數(shù)高通量篩選的局限，以單細(xì)胞為觀測(cè)單元，同步捕獲細(xì)胞形態(tài)、熒光信號(hào)、亞細(xì)胞定位、動(dòng)態(tài)時(shí)序等多維度生物學(xué)信息，實(shí)現(xiàn)基于細(xì)胞表型的規(guī)模化篩選與機(jī)制解析。
整套技術(shù)體系分為兩大核心模塊：一是自動(dòng)化多通道成像單元，通過(guò)多色熒光、明場(chǎng)、共聚焦光路采集多孔板內(nèi)細(xì)胞圖像；二是智能圖像分析模塊，依托算法分割細(xì)胞結(jié)構(gòu)，批量提取量化特征，將可視化圖像轉(zhuǎn)化為可統(tǒng)計(jì)的多維數(shù)據(jù)集。和傳統(tǒng)終點(diǎn)式檢測(cè)不同，高內(nèi)涵篩選可同步記錄同一細(xì)胞群體數(shù)十項(xiàng)特征，用于區(qū)分化合物、基因擾動(dòng)帶來(lái)的細(xì)微表型差異，適配藥物研發(fā)、3D類器官、活細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀測(cè)等研究場(chǎng)景。
橫河電機(jī)CellVoyager CV8000高內(nèi)涵篩選平臺(tái)以雙轉(zhuǎn)盤共聚焦光路為成像基礎(chǔ)，搭建適配多類樣本的硬件體系，將高速掃描、活細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境、自動(dòng)化移液模塊與多相機(jī)成像單元整合，支撐從樣品孵育、動(dòng)態(tài)給藥、長(zhǎng)時(shí)間延時(shí)成像到數(shù)據(jù)解析的完整篩選流程，為標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供硬件支撐。
1.共聚焦成像核心邏輯
設(shè)備搭載雙轉(zhuǎn)盤共聚焦掃描單元，圓盤集成微透鏡陣列與螺旋排布針孔陣列，同步輸出多束激光并行掃描樣本，每秒可完成千幀級(jí)圖像采集。雙盤結(jié)構(gòu)可降低成像過(guò)程中細(xì)胞受到的光損傷與光漂白，適配長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞觀測(cè)；搭配可切換規(guī)格針孔盤，針對(duì)厚層3D樣本更換小孔徑針孔提升層析清晰度，針對(duì)弱熒光樣本更換大孔徑針孔提升圖像亮度，平衡成像深度與信號(hào)強(qiáng)度。
2.活細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀測(cè)配套原理
設(shè)備內(nèi)置密閉式載物臺(tái)培養(yǎng)腔，可穩(wěn)定調(diào)控溫度、濕度、CO?濃度，維持細(xì)胞生理環(huán)境穩(wěn)定，連續(xù)觀測(cè)時(shí)長(zhǎng)可達(dá)72小時(shí)以上。配套集成機(jī)器人移液器，可在成像進(jìn)程中自動(dòng)完成試劑吸取、孔板給藥、吸頭丟棄操作，支持單次或多次藥物刺激，捕捉給藥前后細(xì)胞快速動(dòng)態(tài)反應(yīng)，適配鈣信號(hào)波動(dòng)、蛋白轉(zhuǎn)位等短時(shí)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。
3.多通道與無(wú)標(biāo)記成像邏輯
光學(xué)系統(tǒng)支持四路sCMOS相機(jī)同步采集，單塊96孔板可在一分鐘內(nèi)完成四種熒光通道成像，兼容FRET、CellPainting等多標(biāo)記檢測(cè)方案。除熒光成像外，設(shè)備可沿Z軸分層采集明場(chǎng)圖像，通過(guò)配套軟件重構(gòu)CE明場(chǎng)視圖，無(wú)需熒光染料即可完成細(xì)胞識(shí)別，減少標(biāo)記試劑對(duì)細(xì)胞生理狀態(tài)的干擾。
二、實(shí)驗(yàn)全流程參數(shù)優(yōu)化要點(diǎn)
完整高內(nèi)涵篩選實(shí)驗(yàn)分為樣品制備參數(shù)、成像硬件參數(shù)、孵育動(dòng)力學(xué)參數(shù)三個(gè)優(yōu)化維度，參數(shù)匹配度直接影響圖像信噪比與數(shù)據(jù)可重復(fù)性，結(jié)合CellVoyager CV8000平臺(tái)特性，分模塊梳理優(yōu)化方向。
（一）細(xì)胞與樣品制備參數(shù)優(yōu)化
1.細(xì)胞鋪板密度
根據(jù)觀測(cè)目標(biāo)調(diào)整接種數(shù)量：?jiǎn)螌淤N壁細(xì)胞常規(guī)篩選選用適中密度，避免細(xì)胞堆疊造成分割誤差；3D類器官、細(xì)胞球需降低鋪板濃度，保證球體分散無(wú)粘連。設(shè)備配套72小時(shí)活細(xì)胞驗(yàn)證數(shù)據(jù)顯示，96孔板四角孔易出現(xiàn)細(xì)胞增殖偏弱現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)可增設(shè)空白對(duì)照孔校正邊緣效應(yīng)，統(tǒng)計(jì)階段剔除邊緣孔數(shù)據(jù)減少偏差。
2.標(biāo)記方案選擇
固定細(xì)胞實(shí)驗(yàn)可采用多色熒光標(biāo)記，區(qū)分細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器靶標(biāo)；活細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀測(cè)優(yōu)先選用低毒性熒光探針，或采用平臺(tái)無(wú)標(biāo)記成像模式，通過(guò)深度學(xué)習(xí)算法識(shí)別明場(chǎng)細(xì)胞輪廓，省去染色步驟、縮短實(shí)驗(yàn)周期。3D厚樣本優(yōu)先搭配水浸式物鏡，40倍、60倍水浸鏡頭可自動(dòng)供水，校正球面像差，提升深層細(xì)胞熒光采集亮度。
3.對(duì)照體系設(shè)置
每組篩選需同步設(shè)置空白對(duì)照、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照：空白孔僅含培養(yǎng)基，扣除背景熒光；陰性對(duì)照為未施加擾動(dòng)的正常細(xì)胞，作為表型基準(zhǔn)；陽(yáng)性對(duì)照采用已知活性刺激物，驗(yàn)證成像與分析體系的信號(hào)區(qū)分能力，用于后續(xù)數(shù)據(jù)歸一化校準(zhǔn)。
（二）成像硬件參數(shù)優(yōu)化
1.針孔盤與Z軸步長(zhǎng)匹配
單層薄樣本選用50μm針孔盤，提升成像速度與信號(hào)亮度；類器官、細(xì)胞球等厚層樣本切換25μm針孔盤，提升層析分辨能力。Z軸掃描步長(zhǎng)根據(jù)物鏡倍率調(diào)整，高倍觀測(cè)細(xì)微亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)縮小步長(zhǎng)，低倍整孔全景成像可適度放大步長(zhǎng)，平衡掃描耗時(shí)與圖像完整性。
2.激光強(qiáng)度與曝光時(shí)長(zhǎng)
活細(xì)胞延時(shí)成像需下調(diào)激光功率、縮短單幀曝光時(shí)間，降低光毒性；終點(diǎn)固定樣本可適度提升曝光，保證弱熒光靶標(biāo)信號(hào)可識(shí)別。平臺(tái)四路相機(jī)可獨(dú)立調(diào)整各通道曝光參數(shù)，避免強(qiáng)熒光通道信號(hào)溢出掩蓋弱表達(dá)靶標(biāo)。
3.通量與成像視野平衡
若以大規(guī)模化合物篩選為目標(biāo)，選用低倍物鏡、單孔少量視野采集，縮短整塊板掃描時(shí)長(zhǎng)；若側(cè)重單細(xì)胞精細(xì)表型分析，選用水浸高倍物鏡、增加單孔拍攝視野數(shù)量。設(shè)備四路相機(jī)并行采集模式可同步獲取多色通道圖像，減少重復(fù)掃描對(duì)樣本的光損傷。
（三）孵育與動(dòng)力學(xué)給藥參數(shù)優(yōu)化
1.長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞孵育參數(shù)
載物臺(tái)培養(yǎng)腔提前預(yù)溫平衡濕度與CO?濃度，減少細(xì)胞環(huán)境波動(dòng)；72小時(shí)以上延時(shí)實(shí)驗(yàn)，統(tǒng)一控制孔板液體體積，降低蒸發(fā)帶來(lái)的滲透壓變化。對(duì)比常規(guī)CO?培養(yǎng)箱驗(yàn)證數(shù)據(jù)，排除四角孔后，設(shè)備內(nèi)細(xì)胞增殖水平與獨(dú)立培養(yǎng)箱保持接近，可滿足長(zhǎng)周期動(dòng)態(tài)追蹤需求。
2.自動(dòng)化給藥時(shí)序參數(shù)
動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)需設(shè)置移液器吸頭更換頻次、試劑滴注速度、給藥間隔時(shí)長(zhǎng)；針對(duì)快速細(xì)胞響應(yīng)（如鈣離子信號(hào)），設(shè)置0.2秒級(jí)間隔延時(shí)成像，同步記錄給藥前后細(xì)胞熒光變化；多梯度給藥實(shí)驗(yàn)可分批次添加不同濃度化合物，分段采集圖像，構(gòu)建濃度-表型關(guān)聯(lián)曲線。
三、標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)分析完整流程
CellVoyager CV8000配套CellPathfinder分析軟件，整合圖像校正、細(xì)胞分割、特征提取、AI分類、數(shù)據(jù)可視化全鏈路功能，數(shù)據(jù)分析流程分為五步，適配標(biāo)記成像與無(wú)標(biāo)記明場(chǎng)兩類樣本數(shù)據(jù)。
1.原始圖像預(yù)處理校正
成像完成后第一步完成背景校正、熒光通道均衡、明暗場(chǎng)對(duì)齊：扣除空白孔背景信號(hào)消除板底自發(fā)熒光；對(duì)多通道圖像做位移校準(zhǔn)，保證同一細(xì)胞多色信號(hào)空間匹配；Z軸堆疊圖像完成層間對(duì)齊，去除掃描位移偏差，降低后續(xù)分割誤差。
2.細(xì)胞與亞結(jié)構(gòu)圖像分割
分割是數(shù)據(jù)分析的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，分兩種路徑：
熒光標(biāo)記樣本：依托核、胞質(zhì)特異性熒光信號(hào)，算法自動(dòng)勾勒單個(gè)細(xì)胞邊界，區(qū)分細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、線粒體等亞區(qū)域；
無(wú)標(biāo)記明場(chǎng)樣本：疊加多層Z軸明場(chǎng)圖像生成CE視圖，搭配深度學(xué)習(xí)模型識(shí)別細(xì)胞輪廓，無(wú)需熒光信號(hào)即可完成單細(xì)胞分割，減少標(biāo)記帶來(lái)的實(shí)驗(yàn)偏差。
針對(duì)細(xì)胞擁擠、堆疊區(qū)域，軟件內(nèi)置分割優(yōu)化模板，可調(diào)整邊界識(shí)別閾值，區(qū)分粘連細(xì)胞，提升單細(xì)胞統(tǒng)計(jì)準(zhǔn)確度。
3.多維度生物學(xué)特征提取
分割完成后批量輸出單細(xì)胞量化參數(shù)，主要分為三類：
1.形態(tài)參數(shù)：細(xì)胞面積、圓度、長(zhǎng)寬比、細(xì)胞核體積、突觸長(zhǎng)度等，反映細(xì)胞增殖、分化、形態(tài)損傷；
2.熒光信號(hào)參數(shù)：各通道熒光總強(qiáng)度、平均強(qiáng)度、蛋白共定位系數(shù)、信號(hào)胞內(nèi)分布比例，用于評(píng)估靶標(biāo)表達(dá)量與轉(zhuǎn)位現(xiàn)象；
3.空間時(shí)序參數(shù)：細(xì)胞遷移距離、給藥前后熒光變化幅度、群體細(xì)胞分布密度，適配動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。
3D類器官樣本可同步提取球體體積、內(nèi)部細(xì)胞數(shù)量、分層熒光分布等立體特征，適配三維培養(yǎng)模型篩選。
4.AI輔助表型分類與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
依托軟件內(nèi)置機(jī)器學(xué)習(xí)、深度學(xué)習(xí)模塊，完成無(wú)偏數(shù)字化表型評(píng)估：操作人員標(biāo)注少量典型表型細(xì)胞圖像后，算法自動(dòng)學(xué)習(xí)特征規(guī)律，批量區(qū)分不同處理組細(xì)胞表型；針對(duì)大規(guī)模篩選數(shù)據(jù)集，開展聚類分析，將化合物按細(xì)胞響應(yīng)模式分組，快速篩選出具備生物活性的樣本。
數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)階段利用對(duì)照組完成歸一化處理，計(jì)算各組特征差異幅度，輸出標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)值；支持批量剔除異常孔、異常單細(xì)胞數(shù)據(jù)，降低孔板邊緣、細(xì)胞污染帶來(lái)的干擾。
5.結(jié)果可視化與數(shù)據(jù)導(dǎo)出
所有量化數(shù)據(jù)可聯(lián)動(dòng)原始細(xì)胞圖像，點(diǎn)擊數(shù)值即可跳轉(zhuǎn)對(duì)應(yīng)單細(xì)胞視野，方便結(jié)果復(fù)核；軟件內(nèi)置多類圖表模板，生成折線時(shí)序圖、散點(diǎn)分布圖、分組柱狀圖，直觀展示濃度梯度、時(shí)間梯度下的細(xì)胞表型變化。處理完成的數(shù)據(jù)可導(dǎo)出通用表格格式，對(duì)接下游統(tǒng)計(jì)工具開展深度挖掘，完整記錄從成像到分析的全部操作流程，便于實(shí)驗(yàn)溯源。
四、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)整體協(xié)同邏輯
高內(nèi)涵篩選的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)需要實(shí)現(xiàn)生物學(xué)方案、硬件成像參數(shù)、數(shù)據(jù)分析算法三者協(xié)同匹配：先基于研究目標(biāo)確定細(xì)胞模型、擾動(dòng)條件與觀測(cè)表型，再根據(jù)樣本類型調(diào)整設(shè)備共聚焦、物鏡、孵育、給藥參數(shù)，最后配套對(duì)應(yīng)圖像分割與AI分析模板。
CellVoyager CV8000一體化平臺(tái)打通細(xì)胞培養(yǎng)、自動(dòng)化成像、智能分析全鏈條，硬件層面的高速共聚焦、穩(wěn)定活細(xì)胞環(huán)境、自動(dòng)化移液模塊，搭配CellPathfinder軟件的無(wú)標(biāo)記分析與深度學(xué)習(xí)能力，可適配單層活細(xì)胞延時(shí)觀測(cè)、3D類器官篩選、快速動(dòng)力學(xué)給藥、無(wú)標(biāo)記細(xì)胞表型檢測(cè)等多元實(shí)驗(yàn)方案，為標(biāo)準(zhǔn)化、可重復(fù)的高內(nèi)涵篩選實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供完整支撐。
相關(guān)產(chǎn)品
免責(zé)聲明
- 凡本網(wǎng)注明“來(lái)源：化工儀器網(wǎng)”的所有作品，均為浙江興旺寶明通網(wǎng)絡(luò)有限公司-化工儀器網(wǎng)合法擁有版權(quán)或有權(quán)使用的作品，未經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)不得轉(zhuǎn)載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)使用作品的，應(yīng)在授權(quán)范圍內(nèi)使用，并注明“來(lái)源：化工儀器網(wǎng)”。違反上述聲明者，本網(wǎng)將追究其相關(guān)法律責(zé)任。
- 本網(wǎng)轉(zhuǎn)載并注明自其他來(lái)源（非化工儀器網(wǎng)）的作品，目的在于傳遞更多信息，并不代表本網(wǎng)贊同其觀點(diǎn)和對(duì)其真實(shí)性負(fù)責(zé)，不承擔(dān)此類作品侵權(quán)行為的直接責(zé)任及連帶責(zé)任。其他媒體、網(wǎng)站或個(gè)人從本網(wǎng)轉(zhuǎn)載時(shí)，必須保留本網(wǎng)注明的作品第一來(lái)源，并自負(fù)版權(quán)等法律責(zé)任。
- 如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題，請(qǐng)?jiān)谧髌钒l(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系，否則視為放棄相關(guān)權(quán)利。
采購(gòu)中心