Fig.1：來源于Arhgap26的新型環(huán)狀RNA分子circArhgap26在I/R模型小鼠的心臟梗死邊緣區(qū)及血清中均顯著下調(diào)；同時，在經(jīng)歷缺氧/復(fù)氧(H/R)或氧化應(yīng)激處理的心肌細(xì)胞以及PCI患者的血漿中同樣呈低表達(dá)。進(jìn)一步驗證表明，CircArhgap26由Arhgap26初級轉(zhuǎn)錄本經(jīng)反向剪接形成，具有circRNAs典型的RNase R耐受性，并主要定位于心肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。上述結(jié)果提示，circArhgap26可能深度參與I/R損傷的病理進(jìn)程，并具備作為相關(guān)疾病診斷標(biāo)志物的潛力。

Fig.2：體內(nèi)功能實(shí)驗顯示，特異性過表達(dá)circArhgap26可顯著改善I/R模型小鼠的心功能，表現(xiàn)為射血分?jǐn)?shù)(EF)與短軸縮短率(FS)的提升，同時，血清LDH水平顯著降低，心肌組織Caspase-3活性受到抑制，梗死面積縮小，心肌細(xì)胞凋亡率下降。進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)，circArhgap26能顯著下調(diào)促凋亡蛋白Bax并上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。上述結(jié)果證實(shí)，circArhgap26通過拮抗心肌細(xì)胞凋亡，能有效減輕I/R損傷，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

Fig.3：該研究通過circRNA下拉結(jié)合質(zhì)譜分析，鑒定出PKP1是circArhgap26的關(guān)鍵互作蛋白；隨后通過RNA免疫沉淀(RIP)、pull-down實(shí)驗、分子對接及共定位分析，證實(shí)了二者的直接結(jié)合。值得注意的是，H?O?刺激及I/R損傷均顯著下調(diào)了心肌細(xì)胞及心臟組織中PKP1蛋白的表達(dá)水平。RIP實(shí)驗進(jìn)一步證實(shí)了circArhgap26與PKP1的相互作用嚴(yán)格依賴于PKP1的特定結(jié)構(gòu)域。上述發(fā)現(xiàn)揭示了circArhgap26通過靶向PKP1調(diào)控心肌缺血損傷的新機(jī)制。

Fig.4：為明確PKP1在體內(nèi)的功能，研究構(gòu)建了AAV9介導(dǎo)的PKP1敲低小鼠模型。結(jié)果顯示，抑制PKP1能顯著改善I/R損傷小鼠的心功能，表現(xiàn)為心功能指標(biāo)EF與FS的顯著提升；同時伴隨血清LDH水平及心肌組織Caspase-3活性的降低，梗死面積縮小，心肌細(xì)胞凋亡率下降。在分子水平上，抑制PKP1能夠下調(diào)Bax表達(dá)、同時上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)了Bax/Bcl-2失衡。上述表型與circArhgap26過表達(dá)的效果高度一致，表明抑制PKP1可通過調(diào)控凋亡通路減輕心肌I/R損傷，從而發(fā)揮確切的心肌保護(hù)作用。

Fig.5:為確定二者的遺傳上下游關(guān)系，研究開展了circArhgap26與PKP1的共過表達(dá)挽救實(shí)驗。結(jié)果顯示，過表達(dá)PKP1可顯著逆轉(zhuǎn)circArhgap26上調(diào)對I/R誘導(dǎo)心肌損傷的保護(hù)效應(yīng)，表現(xiàn)為EF、FS下降，血清LDH、心肌Caspase-3活性升高，梗死面積擴(kuò)大，心肌細(xì)胞凋亡加劇，同時Bax表達(dá)上調(diào)、Bcl2表達(dá)下調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)表明circArhgap26的心肌保護(hù)作用依賴于對PKP1的抑制，二者在心肌I/R損傷調(diào)控中存在直接的功能拮抗關(guān)系。

Fig.6：研究證實(shí)，circArhgap26可通過抑制PKP1的棕櫚酰化修飾，降低其蛋白穩(wěn)定性進(jìn)而促進(jìn)降解。機(jī)制研究表明，過表達(dá)circArhgap26不僅顯著下調(diào)心肌細(xì)胞中PKP1的表達(dá)水平，還在CHX處理下加速了PKP1的降解過程。值得注意的是，棕櫚酰化抑制劑2-BP能模擬circArhgap26的效應(yīng)，顯著降低PKP1的棕櫚酰化水平與蛋白穩(wěn)定性。反之，過表達(dá)circArhgap26也可直接抑制PKP1的棕櫚酰化修飾。上述數(shù)據(jù)表明circArhgap26對PKP1的調(diào)控依賴于對其棕櫚酰化修飾的抑制作用，這一機(jī)制是circArhgap26發(fā)揮心肌保護(hù)功能的關(guān)鍵分子基礎(chǔ)。

Fig.7：研究進(jìn)一步闡明了circArhgap26調(diào)控PKP1的分子機(jī)制：circArhgap26通過競爭性結(jié)合PKP1的ARM1結(jié)構(gòu)域，有效阻斷棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶ZDHHC1與PKP1的相互作用，從而抑制ZDHHC1介導(dǎo)的PKP1棕櫚酰化修飾。敲低ZDHHC1或突變PKP1的棕櫚酰化位點(diǎn)(C14S/C136S)均能顯著降低PKP1的棕櫚酰化水平并促進(jìn)其降解。其表型與circArhgap26過表達(dá)高度吻合：不僅能抑制PKP1與ZDHHC1的結(jié)合，還阻斷了后續(xù)的棕櫚酰化修飾，最終降低PKP1的蛋白穩(wěn)定性。這一競爭性結(jié)合機(jī)制是circArhgap26抑制PKP1、發(fā)揮心肌保護(hù)作用的核心分子基礎(chǔ)。

Fig.8：該研究進(jìn)一步揭示了PKP1的下游效應(yīng)機(jī)制：PKP1能夠特異性結(jié)合APAF1 mRNA的5'UTR區(qū)域，通過增強(qiáng)其翻譯效率（而非影響mRNA穩(wěn)定性），顯著上調(diào)APAF1的蛋白表達(dá)。敲低PKP1可顯著減少多聚核糖體結(jié)合的APAF1 mRNA，降低APAF1的翻譯水平，并抑制下游caspase-9與caspase-3的活化，有效阻斷了線粒體凋亡通路的激活。上述數(shù)據(jù)表明，PKP1通過正向調(diào)控APAF1的翻譯過程激活線粒體凋亡通路，而circArhgap26通過抑制PKP1的蛋白穩(wěn)定性，成功阻斷這一促凋亡信號軸，最終實(shí)現(xiàn)對心肌I/R損傷的保護(hù)作用。