大鼠腦動脈平滑肌細胞是分離自大鼠腦動脈中膜的原代細胞，是研究腦血管生理功能及病理機制的重要體外模型。下面整理一份可直接照著做、實驗室常用、成功率高的大鼠腦動脈平滑肌細胞（原代）分離與培養完整 SOP，步驟寫得非常細，你直接照著操作就行。

一、試劑與器材準備

無菌 PBS（不含 Ca2?/Mg2?）

解剖液：DMEM/F12 + 雙抗

消化液 A：0.1% 膠原酶 Ⅰ

消化液 B：0.1% 膠原酶 Ⅰ + 0.05% 胰蛋白酶

培養基：DMEM/F12 + 15% FBS + 雙抗 + 1% 谷氨酰胺

明膠或多聚賴氨酸包被的培養瓶/皿

無菌解剖器械：彎剪、直剪、顯微鑷 2 把、培養皿

二、動物取材（關鍵！）

取4～6 周 SD/Wistar 大鼠，麻醉后 75% 乙醇消毒。

迅速斷頭，取全腦，置于預冷無菌 PBS 中。

在體視顯微鏡下，分離腦基底動脈環 + 大腦前/中/后動脈。

仔細剝離血管表面結締組織、脂肪、腦膜。

用顯微鑷輕輕刮擦血管腔內表面，去除內皮細胞。

將干凈血管移入含解剖液的小皿中。

要點：血管越干凈，后續純度越高。

三、組織剪碎

用眼科剪將血管剪成1 mm3 以下的細小組織塊。

四、兩步消化法（存活率高）

加入消化液 A（0.1% 膠原酶 Ⅰ）

37℃孵育 20 min，輕輕吹打。

棄上清，加入消化液 B

37℃孵育 15～20 min，每 5 分鐘輕彈一次。

當液體變渾濁、組織塊松散，即消化完成。

加入培養基終止消化（血清終止胰酶）。

五、過濾、離心、重懸

用70 μm 細胞篩過濾，去除未消化組織塊。

1000 rpm（約 250 g）離心 5 min。

棄上清，用培養基重懸細胞。

六、接種與培養

接種到明膠/多聚賴氨酸包被的培養瓶。

置于 37℃、5% CO? 培養箱。

接種后 6～12 h 換液，去除未貼壁細胞。

之后每 2 天換液一次。

原代細胞一般 3～7 天 達到 80%～90% 匯合。

七、傳代（P0→P1）

棄培養基，PBS 洗 1 次。

加 0.25% 胰酶，37℃消化 1～2 min。

顯微鏡下見細胞回縮、變圓即終止。

離心、重懸，按 1:2 或 1:3 傳代。

建議實驗用：P1～P4，代數太高會表型漂移。

八、細胞鑒定（必做）

免疫熒光：α-SMA 陽性

陰性：CD31（內皮）、GFAP（膠質）

純度一般可達 90%～95%。

九、最容易失敗的 3 個點（避坑指南）

血管沒剝干凈 → 雜細胞多，平滑肌長不起來

消化過度/不足 → 細胞死或不貼壁

沒包被 → 貼壁差，大量漂浮

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