細胞凋亡檢測

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主流方法+攻略詳解+實驗好物

細胞凋亡作為程序性死亡的核心形式，在發育調控、疾病機制(如癌癥、免疫缺陷)及藥物研發中具有重要研究價值。細胞凋亡的主要形態學特征包括：染色質固縮、DNA片段化、細胞膜起泡、細胞皺縮、凋亡小體的形成等。

針對其復雜動態過程，我們該如何檢測細胞凋亡？不同實驗場景該選哪種方法？如何避免選型誤區？如何提升檢測數據的準確性？本文系統梳理細胞凋亡檢測的核心方法，對比各方法的優劣勢與適用場景，幫您高效完成實驗。

目前至少有數十種檢測細胞凋亡的方法，可以大致劃分為基于細胞形態、生物學功能和生化標記三大類。

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基于生物學功能的方法

1.1 線粒體膜電位的檢測

凋亡早期細胞，線粒體膜通透性增加，線粒體膜電位 (ΔΨm) 下降甚至消失。線粒體膜電位的下降被認為是細胞凋亡過程中最早發生的生物學變化。一旦線粒體膜電位被破壞，細胞凋亡將不可逆轉。目前常用一些親脂性陽離子染料如JC-10、JC-1檢測線粒體膜電位的變化。線粒體膜電位較高時，JC-1在基質中匯聚形成聚合物，可以產生紅色熒光 (Ex/Em=585/590 nm)；線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體基質中，以單體形式存在產生綠色熒光 (Ex/Em=515/529 nm)。

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結果展示

1.2 細胞膜表面磷脂酰絲氨酸 (PS) 的檢測

在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸 (PS)位于細胞膜內側；細胞凋亡早期，PS會外翻到細胞膜外側。Annexin V (膜聯蛋白 V)是一種 Ca²⁺依賴性磷脂結合蛋白，可與 PS 特異性結合，因此 Annexin V常作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。Annexin V經FITC標記后可發綠色熒光。碘化丙啶 (PI)染色液是一種不能穿透細胞膜的紅色熒光染料，可對凋亡晚期細胞及壞死細胞染色。經 Annexin V-FITC和PI聯合染色后，正常細胞基本無熒光 (Annexin V-/PI-)，早期凋亡細胞呈綠色熒光 (Annexin V+/PI-)，晚期凋亡細胞及壞死細胞則呈綠色和紅色熒光 (Annexin V+/PI+)，機械性損傷的細胞呈紅色熒光（Annexin V-/PI+）。

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1.3 線粒體膜轉換孔檢測

當細胞發生凋亡時，線粒體膜電位轉換孔滲透性發生改變，Ca²⁺的過載，線粒體谷胱甘肽的氧化，活性氧水平的升高，包括后繼細胞色素C的釋放，線粒體膜電位下降等都會導致線粒體滲透性轉換孔的激活。

1.4 細胞凋亡的Ca²⁺濃度變化測定

細胞的生命活動都離不開 Ca²⁺，Ca²⁺超載時，線粒體通透性轉換孔開放，細胞內外Ca²⁺平衡被破壞，導致細胞凋亡。用 Ca²⁺特異性熒光探針，如Fluo-3、Fluo-4、Fluo-8等對細胞進行標記后，再用FCM或熒光、共聚焦顯微鏡檢測，可以準確地檢測細胞凋亡。

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基于生化標記的方法

2.1 凋亡分子標記檢測

Caspase蛋白家族在介導細胞凋亡過程中具有重要的作用。絕大多數情況下，所有的凋亡信號都會匯集到凋亡的最終執行者Caspase-3上。在正常細胞中，Caspase-3 以酶原形式存在，在凋亡早期Caspase-3被激活，并執行最后的凋亡程序。因此可以通過檢測Caspase 3剪切體的含量或Caspase 3的活性來反應細胞凋亡過程。

2.2 DNA片段原位檢測 (TUNEL法)

細胞凋亡時，相關DNA內切酶被激活，進而切斷核小體間的基因組DNA，產生 180-200 bp的DNA ladder，暴露的3’-OH在末端脫氧核苷酸轉移酶 (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上特異熒光探針或生物素標記的dUTP，借助熒光顯微鏡、流式細胞儀或者顯色法即可檢測細胞凋亡的發生。正常或增殖細胞幾乎沒有DNA的斷裂，故很少被染色。

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基于細胞形態學的方法

細胞凋亡時，細胞膜通透性增強，染色質發生固縮，故經PI、Hoechst系列等熒光染料染色后可快速檢測細胞凋亡，凋亡細胞Hoechst 33342染色觀察到強藍色熒光，核碎裂和核凝結。主要有熒光染料雙染和細胞核單染檢測法。

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