（1）更接近腫瘤生態：將患者來源卵巢癌類器官與CAF、間皮細胞、I型膠原和Cultrex基質組合，重建HGSC相關三維微環境；脂肪細胞凝膠可作為可選模塊加入，用于更好模擬大網膜脂肪環境。

（2）樣本來源更靈活：除新鮮腫瘤組織外，也可利用冷凍腫瘤組織消化物和腹水來源富集細胞懸液建立CAF或間皮細胞培養，提高珍貴臨床樣本利用率；脂肪細胞則需從新鮮腫瘤組織中分離并短期培養。

（3）微環境重建：模型含15%基質細胞（12.5%CAF+ 2.5%間皮細胞），脂肪細胞凝膠可作為可選模塊加入，以模擬大網膜轉移灶的脂肪環境。

（4）多維讀出：支持免疫熒光成像、mCherry標記類器官追蹤、高內涵成像藥敏測試及scRNA-seq分析，可同時觀察癌細胞和基質細胞反應。

（5）轉化潛力：384孔板微型化方案支持12天藥敏流程；4個患者來源模型在scRNA-seq前處理后細胞活率達72%–95%。

02 研究內容

1.為什么只做類器官還不夠？

卵巢癌藥物反應不是腫瘤細胞單獨決定的。腫瘤周圍的 CAF、間皮細胞、脂肪細胞和細胞外基質會影響細胞黏附、生長因子信號、營養狀態、藥物擴散和應激反應。單純依賴二維細胞系或只含腫瘤上皮成分的類器官，難以充分反映真實腫瘤中的耐藥生態。

這篇文章的切入點很明確：要研究HGSC的治療抵抗，就不能把腫瘤細胞從微環境中"剝離"出來。研究團隊真正要解決的是，如何把類器官組織成一個可分析、可干預、可擴展的腫瘤微環境模型。

圖2 MC模型組成邏輯：患者來源類器官與CAF、間皮細胞及ECM組分共同構成基礎MC模型；脂肪細胞凝膠可作為可選模塊加入，以模擬大網膜轉移相關的脂肪環境。

2.第一步：建立患者來源基質細胞

MC模型的基礎不是“把細胞混在一起”，而是先獲得穩定且身份明確的基質細胞。文章分別給出了CAF、間皮細胞和脂肪細胞的獲取與培養方案，并重點提供了CAF和間皮細胞的身份驗證方法。對于新鮮實體瘤樣本，研究團隊處理來自大網膜或腹膜、肉眼可見腫瘤的組織：建立CAF時選擇無壞死、無血管、無脂肪的區域；分離脂肪細胞時則選擇含脂肪、但避開壞死和血管的區域。無脂肪區域可切成約2mm×2mm組織塊，用于建立CAF培養；含脂肪區域可切成約5mm×5mm組織塊，經膠原酶/透明質酸酶消化后收集脂肪層，用于建立脂肪細胞培養。

圖3 新鮮腫瘤樣本處理：無脂肪腫瘤區域主要用于建立CAF培養，含脂肪區域則用于分離脂肪細胞，從源頭上區分不同微環境組分。

對于冷凍保存樣本，文章提供了另一條路線：冷凍腫瘤組織消化物可建立CAF，冷凍腹水來源富集細胞懸液更適合建立間皮細胞。這一點至關重要——臨床樣本往往稀缺、分批獲得且難以即時處理，從冷凍材料中恢復并擴增CAF或間皮細胞，意味著模型建設可以更靈活地對接樣本庫和后續實驗。

細胞身份驗證是關鍵節點。CAF通常呈梭形形態，表達PDGFRβ，部分表達FAP，不表達HGSC標志物PAX8；間皮細胞呈鋪路石樣形態，表達calretinin（CALB2）。只有身份經驗證的基質細胞，才建議進入后續擴增、凍存和模型組裝。

圖4 CAF培養與鑒定：患者來源CAF呈梭形形態，并通過PDGFRβ、FAP、PAX8等標志物確認其基質細胞身份和非腫瘤上皮屬性。

圖5 間皮細胞培養與鑒定：間皮細胞表現為鋪路石樣形態，并可通過CALB2/calretinin和細胞骨架染色進行驗證。

3.第二步：用類器官、CAF、間皮細胞和細胞外基質重建MC模型

當患者來源類器官恢復增殖、CAF和間皮細胞處于活躍生長狀態后，研究者將它們共同包埋到Cultrex與I型膠原組成的基質中，形成三維dome結構。

標準方案中，MC模型含15%基質細胞（12.5%CAF+ 2.5%間皮細胞）。脂肪細胞凝膠還可連接到MC dome 上，作為模擬大網膜脂肪微環境的可選模塊。

圖6 脂肪細胞模塊加入策略：脂肪細胞凝膠可通過小體積膠原液滴固定在MC dome上方或多個dome之間，用于模擬大網膜轉移相關脂肪環境。

整個組裝過程約2小時：細胞計數后與Cultrex/I 型膠原混合基質重懸，每孔接種10個20μL dome，37℃孵育成膠，再加入含Y-27632的培養基幫助細胞恢復。模型通常可培養10–14天。

這一步的意義在于，類器官不再只是“孤立的三維腫瘤團塊”，而被放入一個由癌細胞、基質細胞和ECM共同參與的可控微環境中。

4.第三步：用mCherry和免疫熒光把癌細胞與基質細胞區分開

多細胞模型的難點在于：細胞混在一起后，如何判斷藥物殺傷的是癌細胞還是基質細胞？文章提供了兩類讀出策略。

第一類是mCherry標記患者來源類器官，使癌細胞在成像中呈紅色信號；第二類是免疫熒光染色，以PAX8標記 HGSC癌細胞，Ki67評估增殖，F-actin展示細胞骨架。通過這些標記，研究者可以觀察不同細胞在三維基質中的空間分布、增殖狀態和藥物反應。

圖7 MC模型成像讀出：免疫熒光中的PAX8、Ki67、F-actin，以及可選的mCherry標記類器官策略，可幫助識別癌細胞、評估增殖狀態，并觀察模型內部空間結構。

這讓MC模型不只是“看起來更復雜”，而是能夠進入定量分析。對藥篩而言，區分癌細胞死亡和基質細胞死亡尤其重要，因為兩者對應的轉化意義和風險判斷較為不同。

5.第四步：把MC模型微型化到384孔板，進入高通量藥物敏感性測試

為了服務藥物篩選，文章進一步建立了384孔板微型化方案。研究者將細胞-基質混合物以10 μL/孔接種到預冷384孔板中，成膠后加入40 μL培養基；第7天加入藥物處理，例如48小時后換液，第12天進行終點檢測。

圖8 384孔藥敏測試示例：MC模型可被微型化到384孔板，并結合高內涵成像區分癌細胞死亡和基質細胞死亡。

終點讀出包括CellTox Green細胞毒性檢測和CellTiter-Glo 2.0細胞活力檢測。若使用mCherry標記類器官，還可結合紅色熒光與死亡信號，分別計算癌細胞死亡和基質細胞死亡。

這套方案的亮點在于把復雜三維多細胞模型接入自動化藥篩系統：液體處理、聲學加藥和高內涵成像可以協同完成，使MC模型不再停留于低通量展示，而是具備平臺化篩選潛力。

6.第五步：將模型處理為適合單細胞RNA測序的細胞懸液

文章還給出了MC模型進入scRNA-seq的處理流程。若模型中含有脂肪細胞凝膠，研究者需先將其去除，再用I型膠原酶和TrypLE分步消化MC dome，經過濾、低速離心和質量檢查后獲得用于單細胞建庫的細胞懸液。

圖9 scRNA-seq樣本制備流程：MC dome需經膠原酶和TrypLE分步消化，獲得適合單細胞建庫的細胞懸液。

需要注意的是，脂肪細胞浮力高、細胞脆弱且體積大，與常規液滴式單細胞平臺不兼容，因此在scRNA-seq處理前需去除。這個細節也提示：模型可以更接近真實腫瘤，但不同下游技術仍有各自邊界。

在作者實驗條件下，4個患者來源模型在未處理或接受卡鉑（10 μM）與紫杉醇（15 nM）8小時處理后，經該流程處理進入scRNA-seq前，細胞活率為72%–95%。這說明MC模型不僅能提供藥物反應讀出，也能進一步解析不同細胞群在藥物刺激后的轉錄狀態。

7.這套模型的邊界在哪里？

該文是一篇protocol，核心價值在于提供可復現的 HGSC三維多細胞建模流程，而非驗證某種藥物的新療效。因此，體外藥物敏感性結果仍需結合進一步臨床驗證，不能單獨作為臨床用藥依據。該模型也有明確邊界：患者來源類器官和基質細胞的建立具有經驗性，成功率難以充分預測；實際操作中，也不一定能從同一患者或同一樣本類型獲得全部所需細胞，必要時可使用非配對基質細胞。此外，盡管模型可納入CAF、間皮細胞、ECM，并可選擇性加入脂肪細胞凝膠，但仍不能等同于完整人體腫瘤。免疫細胞、血管化、流體剪切力、藥代動力學和長期治療壓力等因素尚未充分整合。因此，它更適合作為卵巢癌微環境與藥物反應研究的平臺，而不是臨床驗證的替代品。