豬原代小腸黏膜上皮細(xì)胞是研究腸道生理、營(yíng)養(yǎng)吸收及病原體互作的核心體外模型。下面是整理的豬原代小腸黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)超全細(xì)節(jié)注意事項(xiàng)。

一、取材階段（決定細(xì)胞成活率關(guān)）

1、日齡嚴(yán)格把控

優(yōu)先剛出生未吮乳新生仔豬，出生 2h 內(nèi)；吃過(guò)初乳腸道黏膜易脫落、細(xì)胞活力暴跌，盡量不用。

2、取材部位

選空腸、近端回腸，避開(kāi)十二指腸、結(jié)腸，此處上皮細(xì)胞數(shù)量最多、分化。

3、無(wú)菌極速操作

離體小腸3 分鐘內(nèi)浸入預(yù)冷無(wú)菌 PBS，全程冰上操作，抑制細(xì)胞自溶；腸腔反復(fù)沖凈食糜、膽汁，膽汁會(huì)直接殺傷腸上皮細(xì)胞。

4、剔除雜質(zhì)

刮除腸外脂肪、腸系膜、血管，只留腸壁黏膜層，杜絕間質(zhì)細(xì)胞大量混入。

二、消化關(guān)鍵細(xì)節(jié)（最容易失敗環(huán)節(jié)）

1、消化液溫度

提前 37℃水浴預(yù)熱，溫度不足消化慢，超 38℃直接燙死上皮細(xì)胞。

2、消化酶選擇

只用膠原酶 XI + 分散酶，禁用胰酶長(zhǎng)時(shí)間消化；胰酶極易破壞腸上皮緊密連接，導(dǎo)致細(xì)胞碎死。

3、消化時(shí)長(zhǎng)嚴(yán)控

水浴消化15–20min 封頂，寧短勿長(zhǎng)；鏡下見(jiàn)黏膜蓬松發(fā)白立即終止，超時(shí)細(xì)胞大量凋亡。

4、終止消化必須及時(shí)

立刻加入含血清培養(yǎng)基中和酶活性，不能用純 PBS 終止。

5、吹打力度

輕柔吹打，禁止暴力猛吹，腸上皮細(xì)胞極脆，極易碎成細(xì)胞碎片。

三、過(guò)濾、離心、重懸細(xì)節(jié)

1、濾網(wǎng)規(guī)格

只用70μm 細(xì)胞篩過(guò)濾，去除組織團(tuán)塊；別用 40μm，容易流失完整上皮細(xì)胞。

2、離心參數(shù)固定

800r/min 5min，轉(zhuǎn)速過(guò)高擠壓破損細(xì)胞，過(guò)低沉淀不全。

3、重懸輕柔

槍頭貼壁緩慢吹打，減少氣泡，氣泡會(huì)造成細(xì)胞應(yīng)激死亡。

四、接種鋪板 & 貼壁細(xì)節(jié)

1、培養(yǎng)瓶/板預(yù)處理

提前用0.1% 明膠包被30min 棄液，大幅提升腸上皮貼壁率，裸板貼壁極差。

2、接種密度

原代腸上皮依賴(lài)群體存活，密度不能過(guò)低，過(guò)低不增殖、快速老化。

3、靜置貼壁禁忌

接種后48h 內(nèi)禁止挪動(dòng)、換液！晃動(dòng)會(huì)直接沖掉未牢固貼壁細(xì)胞。

4、培養(yǎng)環(huán)境

恒定37℃、5% CO?、飽和濕度，溫差波動(dòng)直接導(dǎo)致細(xì)胞脫落。

五、換液保養(yǎng)核心細(xì)節(jié)

1、換液時(shí)間

接種48h 后次換液，只輕吸上清，保留底層培養(yǎng)液，留住弱貼壁活細(xì)胞。

2、換液頻率

之后每 2 天換一次全液，腸上皮代謝快，廢液毒素極易損傷細(xì)胞。

3、換液操作

液體沿側(cè)壁緩慢加入，嚴(yán)禁直沖細(xì)胞單層。

4、血清選擇

必須用細(xì)胞專(zhuān)用特級(jí)胎牛血清，普通血清含雜質(zhì)易引發(fā)細(xì)胞分化停滯。

六、培養(yǎng)基添加劑必守細(xì)節(jié)

1、必加組分缺一不可

DMEM/F12 基礎(chǔ)液 + EGF 表皮生長(zhǎng)因子 + ITS 胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白 + 谷氨酰胺

缺少 EGF：細(xì)胞不增殖、快速老化脫落

2、雙抗?jié)舛?/span>

常規(guī) 1% 青霉素 - 鏈霉素即可，不要加高濃度抗生素，會(huì)抑制腸上皮活性。

嚴(yán)禁添加激素類(lèi)雜添加劑，易改變腸上皮屏障功能。

七、純度凈化細(xì)節(jié)（去除成纖維細(xì)胞）

1、差異貼壁純化

成纖維細(xì)胞貼壁快，上皮慢；接種 4h 后輕輕吸走懸浮未貼壁細(xì)胞重新接種，可初步純化。

2、差異消化純化

傳代時(shí)短時(shí)間胰酶消化，成纖維細(xì)胞先脫落，上皮后脫落，分次棄除雜細(xì)胞。

肉眼見(jiàn)梭形雜細(xì)胞立即局部剔除，一旦長(zhǎng)滿(mǎn)污染無(wú)法挽救。

八、污染防控細(xì)節(jié)

全程無(wú)菌操作臺(tái)紫外提前 30min 滅菌，器械無(wú)殘留酒精。

取材腸道內(nèi)部屬于高菌環(huán)境，前期沖洗必須，否則極易大腸桿菌、真菌污染。

一旦出現(xiàn)霧狀渾濁、菌絲、細(xì)胞空泡化，直接舍棄，無(wú)法挽救。

九、凍存與復(fù)蘇細(xì)節(jié)

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞凍存，老化細(xì)胞凍存后復(fù)蘇存活率極低。

凍存液：90%FBS+10%DMSO，不用基礎(chǔ)液配比。

復(fù)蘇快速融化，低速離心洗凈 DMSO，DMSO 殘留嚴(yán)重?fù)p傷腸上皮。

十、常見(jiàn)失敗原因速查

細(xì)胞不貼壁：未明膠包被、血清差、取材仔豬吃過(guò)奶

細(xì)胞貼壁很快大批死亡：消化過(guò)度、膽汁未沖凈、溫度不穩(wěn)

全是梭形雜細(xì)胞：取材脂肪多、未純化、消化方式錯(cuò)誤

細(xì)胞不長(zhǎng)只鋪展：缺少 EGF、接種密度太低

易歐賽生物（EOUCELL）是由北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司開(kāi)創(chuàng)的專(zhuān)注于科研細(xì)胞及其周邊產(chǎn)品研發(fā)及提供的品牌，主要業(yè)務(wù)涵蓋原代細(xì)胞、細(xì)胞系，細(xì)胞培養(yǎng)基及細(xì)胞周邊耗材等！2024年6月30日，北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司與武漢易歐賽生物技術(shù)有限公司簽訂戰(zhàn)略合作協(xié)議，由武漢易歐賽生物技術(shù)有限公司進(jìn)行北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司品牌易歐賽生物的生物技術(shù)支持！