實(shí)驗(yàn)原理

層析法是一種物理分離方法。柱層析法是層析方法中的一個類型，分為吸附柱層析法和分配柱層析法。本實(shí)驗(yàn)僅介紹吸附柱層析法。

吸附柱層析法是分離、純化和鑒定有機(jī)物的重要方法。它是根據(jù)混合物中各組分的分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)（極性）來選擇合適的吸附劑和洗脫劑，從而利用吸附劑對各組分吸附能力的不同及各組分在洗脫劑中的溶解性能不同達(dá)到分離目的。吸附柱層析法通常是在玻璃層析柱中裝入表面積很大、經(jīng)過活化的多孔性或粉狀固體吸附劑（常用的吸附劑有氧化鋁、硅膠等）。當(dāng)混合物溶液流過吸附柱時，各組分同時被吸附在柱的上端，然后從柱頂不斷加入溶劑（洗脫劑）洗脫。由于不同化合物吸附能力不同，從而隨著溶劑下移的速度不同，于是混合物中各組分按吸附劑對它們所吸附的強(qiáng)弱順序在柱中自上而下形成了若干色帶。                     

在洗脫過程中，柱中連續(xù)不斷地發(fā)生吸附和溶解的交替現(xiàn)象。被吸附的組分被溶解吸出來，隨著溶劑向下移動，又遇到新的吸附劑顆粒，把組分從溶液中吸附出來，而繼續(xù)流下的新溶劑又使組分溶解而向下移動，這樣經(jīng)過適當(dāng)時間移動后，各種組分就可以*分開，繼續(xù)用溶劑洗脫，吸附能力zui弱的組分隨溶劑首先流出，再繼續(xù)加溶劑直至各組分依次全部由柱中洗出為止，分別收集各組分。

綠色植物如菠菜葉中的葉綠體含有綠色素（包括葉綠素a和葉綠素b）和黃色素（包括胡蘿卜素和葉黃素）兩大類天然色素。這兩類色素都不溶于水，而溶于有機(jī)溶劑，故可用乙醇或丙酮等有機(jī)溶劑提取。

葉綠素存在兩種結(jié)構(gòu)相似的形式即葉綠素a(C₅₅H₇₂O₅N₄Mg)和葉綠素b(C₅₅H₇₀O₆N₄Mg)，其差別僅是葉綠素a中一個甲基被甲酰基所取代從而形成了葉綠素b。它們都是吡咯衍生物與金屬鎂的絡(luò)合物，是植物進(jìn)行光合作用所必需的催化劑。植物中葉綠素a 的含量通常是b 的3 倍。盡管葉綠素分子中含有一些極性基團(tuán)，但大的烴基結(jié)構(gòu)使它易溶于醚、石油醚等一些非極性的溶劑。

胡蘿卜素（C₄₀H₅₆）是具有長鏈結(jié)構(gòu)的共軛多烯。它有三種異構(gòu)體，即a-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素和γ-胡蘿卜素，其中β-胡蘿卜素含量zui多，也zui重要。在生物體內(nèi)，β-胡蘿卜素受酶催化氧化形成維生素A。目前β-胡蘿卜素已可進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)，可作為維生素A 使用，也可作為食品工業(yè)中的色素。

葉黃素（C₄₀H₅₆O₂）是胡蘿卜素的羥基衍生物，它在綠葉中的含量通常是胡蘿卜素的兩倍。與胡蘿卜素相比，葉黃素較易溶于醇而在石油醚中溶解度較小。

石油醚是一種脂溶性很強(qiáng)的有機(jī)溶劑。葉綠體中的四種色素在石油醚中的溶解度是不同的：溶解度高的隨層析液在濾紙上擴(kuò)散得快；溶解度低的隨層析液在濾紙上擴(kuò)散得慢。溶解度zui高的是胡蘿卜素，它隨石油醚在濾紙上擴(kuò)散得zui快，葉黃素和葉綠素a的溶解度次之；葉綠素b的溶解度zui低，擴(kuò)散得zui慢。這樣，四種色素就在擴(kuò)散過程中分離開來。

同樣，提取液可用色層分析的原理加以分離。因吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同，當(dāng)用適當(dāng)?shù)娜軇┩苿訒r，混合物中各成分在兩相（流動相和固定相）間具有不同的分配系數(shù)，所以它們的移動速度不同，經(jīng)過一定時間層析后，便將混合色素分離。

本實(shí)驗(yàn)是用活性氧化鋁作吸附劑，分離菠菜中胡蘿卜素、葉黃素、葉綠素a和葉綠素b。

實(shí)驗(yàn)試劑

1. 硅膠 G

2. 中性氧化鋁

3. 甲醇

4. 石油醚（ 60-90 ℃）

5. 丙酮

6. 乙酸乙酯

實(shí)驗(yàn)設(shè)備

1. 研缽

2. 布氏漏斗

3. 圓底燒瓶

4. 直形冷凝管

5. 色譜柱

6. 抽濾瓶

7. 燒杯

8. 鐵架臺

9. 脫脂棉723分光光度計

實(shí)驗(yàn)材料

菠菜葉

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 菠菜色素的提取

取2g 新鮮菠菜葉，與10mL 甲醇拌勻研磨5 分鐘，棄去濾液。殘渣用10mL 的石油醚-甲醇（3:2）混合液進(jìn)行提取，共提取兩次。合并液用水洗后棄去甲醇層，石油醚層進(jìn)行干燥、濃縮。

2. 薄層層析

將上述的濃縮液點(diǎn)在硅膠G 的預(yù)制板上，分別用石油醚-丙酮（8:2）和石油醚-乙酸乙酯（6:4）兩種溶劑系統(tǒng)展開，經(jīng)過顯色后，進(jìn)行觀察并計算比移值。

3. 柱層析

取3g 中性氧化鋁進(jìn)行濕法裝柱。填料裝好后，從柱頂加入上述濃縮液，用石油醚-丙酮（9:1）、石油醚-丙酮（7:3）和正丁醇-乙醇-水（3:1:1）進(jìn)行洗脫，依次接收個色素帶，即得胡蘿卜素（橙黃色溶液）、葉黃素（黃色溶液）、葉綠素a（藍(lán)綠色溶液）以及葉綠素b（黃綠色溶液）。

稱取12g堿性三氧化二鋁加入30mL石油醚攪拌，浸泡10min。在層析柱內(nèi)加入一團(tuán)棉花（棉花要盡量薄）在底部再加入0.5cm的石英砂，然后用石油醚半充滿柱子，再將浸泡好的三氧化二鋁倒入柱內(nèi)，倒時應(yīng)該緩慢，重復(fù)使用下面的石油醚，直到裝完。用石油醚洗柱內(nèi)壁，頂部加一小團(tuán)棉花，然后再加入石英砂0.5cm高。

樣品的分離層析

將濃縮液小心地從柱頂部加入。加完后打開活塞，讓液面下降到柱中砂層，關(guān)閉活塞，加幾滴石油醚沖洗內(nèi)壁，打開活塞，使液面下降如前，在柱頂小心加入約1.5—2cm高度的石油醚-丙酮洗脫劑，層析即開始進(jìn)行。

當(dāng)*個有色成分即將滴出時，另取一潔凈的燒杯收集，得黃色溶液，即胡蘿卜素。將洗脫劑換成1：7的石油醚-丙酮混合液，繼續(xù)洗脫可得到第二色帶的黃綠色溶液，即葉綠素a和葉黃素。

注意事項(xiàng)

1. 選材時要注意選取新鮮、顏色深的葉片。

2. 用丙酮和層析液都是易揮發(fā)且有一定毒性的有機(jī)溶劑，所以研磨時要快，收集的濾液要用棉塞塞住，層析時要加蓋，減少有機(jī)溶劑的揮發(fā)。

3. 在研磨時加入少許SiO₂，目的是為了研磨得充分；加入少許CaCO₃的目的是為了防止研磨時葉綠體中色素受到破壞；加入丙酮的目的是作為葉綠體中色素的溶劑。

4. 研磨過程中丙酮要少量多次加入，以免研磨時四處飛濺。

5. 過濾時不要使用濾紙而使用棉花，棉花塞在漏斗基部要松緊適當(dāng)。

6. 葉綠素要避光保存。葉黃素易溶于醇而在石油醚中溶解度較小，從嫩綠菠菜得到的提取液中，葉黃素含量很少，柱色譜中不易分出黃色帶。  

7. 萃取時不要劇烈振蕩，以防止發(fā)生乳化現(xiàn)象。

8. 為了保持柱子的均一性，使整個吸附劑浸泡在溶劑或溶液中是必要的，否則當(dāng)柱中溶劑或溶液流干時，就會使柱身干裂，影響滲透和顯色的均一性。因此要保證整個裝樣過程中溶劑要高于三氧化二鋁的表面。

9. 在吸附劑上端加入脫脂棉（或?yàn)V紙）是使加樣品時不致把吸附劑沖起；在吸附柱下端加脫脂棉（或沙子）可以防止吸附劑細(xì)粒流出。

10. 層析柱填裝緊密與否，對分離效果很有影響，若各部分松緊不勻，會影響滲透速度和顯色的均勻。

11. 注意洗脫劑的配比，胡蘿卜素出來后，換成1：7的洗脫液。

12. 洗脫流速不宜過快，避免因此壓緊凝膠，色素分離不開；也不要過慢，使柱裝得太松，導(dǎo)致層析過程中，凝膠床高度下降，色素洗脫很慢。因此應(yīng)控制洗脫流速，以每分鐘60~80滴為宜。

13. 樣品一定要足夠濃縮，加樣量不要過大或過小。