免疫組化染色方法大匯總
免疫組化的方法很多，新方法層出不窮，如二步法，要不斷更新，與時俱進。雖然這些方法各有其特色，但總的來說，只要應用恰當均可獲得較為滿意的結果。方法 的選擇并不是影響免疫組化結果的主要因素。問題在于一個單位應常規地、固定地使用一種方法，不宜交替使用不同的方法或經常更換方法。一旦選定一種方法，應 務必使其標準化，力圖使一抗、二抗、標記試劑和底物的濃度、孵育時間和濃度、緩沖液的使用程序化、規范化。

一、SP法免疫組化染色
原理
鏈霉素抗生物素蛋白（SA）是從鏈霉素中分離出的蛋白質，穿透組織的能力比ABC、PAP復合物大，反應速度快，它含有四個亞基，每個亞基都有與生物素 （Biotin）連接的部位，且二者間有*的親和力，SA的等電位接近于6.5，近中性，而卵白素（Avidin）為10，因此，SA幾乎不與組織中的 內源性凝集樣物質發生非特異性結合，使用鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化物酶放大系統，即可產生低背景、高放大效果。S－P采用生物素標記的第二抗體與鏈霉素 抗生物素蛋白連接的過氧化物酶及基質素混合液來測定細胞和組織中的抗原。
基本染色方法
1、石蠟切片脫蠟至水；
2、3％H202室溫孵育5～10分鐘，以消除內源性過氧化物酶的活性；
3、蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘，（如需采用抗原修復，可在此步后進行）；
4、5～10％正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育1～2小時或4℃；
5、PBS沖洗，5分鐘×3次；
6、滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗（1％BSA－PBS稀釋），37℃孵育10～30分鐘；或滴加第二代生物素標記二抗工作液，37℃或室溫孵育10～30分鐘；
7、PBS沖洗，5分鐘×3次；
8、滴加適當比例稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素（PBS稀釋），37℃孵育10～30分鐘；或第二代辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育10～30分鐘；
9、PBS沖洗，5分鐘×3次；
10、顯色劑顯色（DAB或AEC）；
11、自來水充分沖洗，復染，封片。
附：冰凍切片免疫組化染色步驟
1、冰凍切片4～8um，室溫放置30分鐘后，入4℃丙酮固定10分鐘，PBS洗，5分鐘×3次。
2、用3％*孵育5～10分鐘，消除內源性過氧化物酶的活性。
3、PBS洗，5分鐘×2次。
4、下接石蠟切片免疫組化染色操作步驟。

二、卵白素－生物素－過氧化物酶復合物法
原理
本方法是利用卵白素與生物素*的高度親和力這一生物學特性，先將生物素與酶結合，形成生物素化HRP，以生物素化HRP與卵白素按一定比例混合，形成一 個復合物。具體步驟是：特異性抗體與組織中抗原結合形成抗原抗體復合物。生物素化二抗再與特異性抗體反應，然后加入ABC復合物，形成抗原＋特異性抗體＋ 生物素化二抗＋卵白素＋生物素＋HRP復合物。zui后DAB顯色。
基本染色方法
1、切片常規脫蠟至水；
2、PBS洗5分鐘×2次；
3、0.3％甲醇－H2O2 30分鐘，37℃；
4、PBS洗5分鐘×2次；
5、正常動物血清20分鐘，37℃；
6、適當稀釋的特異性抗體60分鐘，37℃；
7、PBS洗5分鐘×2次；
8、適當稀釋的生物素標記二抗，30分鐘，37℃；
9、PBS洗5分鐘×2次；
10、ABC復合物30－60分鐘，37℃；
11、PBS洗5分鐘×2次；
12、DAB顯色，鏡下控制；
13、蘇木素襯染、脫水、透明、中性樹膠封固。
附：微波－ABC法具體操作
1、常規脫蠟：二甲苯I、II各10分鐘，*I、II各10分鐘；
2、將切片置入裝有PBS液的染色缸中，微波修復1分鐘，冷卻置室溫；
3、滴加*抗體，微波修復1分鐘，孵育20分鐘，PBS液沖洗3缸×3分鐘；
4、滴加第二抗體，微波修復1分鐘，孵育10分鐘，PBS液沖洗3缸×3分鐘；
5、滴加第三抗體，微波修復1分鐘，孵育10分鐘，PBS液沖洗3缸×3分鐘；
6、DAB顯色，（顯微鏡下控制）終止顯色，蒸餾水水沖洗。
7、蘇木素襯染，鹽酸酒精分化，水洗，封片。

三、直接法
原理
用酶標記的特異性抗體直接與標本中的相應抗原反應結合，再與酶的底物作用產生有色的產物，沉積在抗原－抗體反應的部位。
優點：簡單、步驟少、省時、特異性強、非特異染色較輕；
缺點：敏感性差。
基本染色方法
1、切片常規脫蠟至水，PBS液，洗5分鐘；
2、1：20稀釋的正常血清處理切片20分鐘；
3、滴加適當稀釋酶標抗體，放在濕盒中，37℃，30～60分鐘；
4、PBS洗5分鐘×2次；
5、顯色，鏡下控制；
6、蘇木素襯染、脫水、透明、中性樹脂封固。

四、間接法
原理
先用未標記的特異性抗體（一抗）與標本中的相應抗原反應，再用抗特異性抗體的酶標記抗體與結合在抗原上的一抗反應。
優點：方法簡便、敏感性較直接法高；
缺點：非特異染色較多。
基本染色方法
1、與直接法（1）～（2）相同；
2、滴加適當稀釋的特異性抗體，4℃到第二天，或室溫30～60分鐘；
3、PBS洗5分鐘×2次；
4、滴加酶標記抗體，室溫30分鐘；
5、后同直接法。

五、酶橋法
原理
用化學交聯法將酶與抗體分子連接，染色時在特異性抗體與標本中抗原結合之后，用橋抗體結合于其上，再將抗酶抗體結合于橋抗體上，zui后把酶結合在酶抗體上，經過底物的呈色反應而將抗原顯示出來。
優點：提高了方法的敏感性，非特異染色較輕；
缺點：抗酶抗體必須是價、經過高度純化，否則將降低敏感性。
基本染色方法
1、組織切片脫蠟至水，PBS洗5分鐘×2次；
2、用.。3％H2O2－甲醇在室溫中處理切片5～30分鐘；
3、充分水洗后，PBS洗5分鐘×2次；
4、1：20稀釋正常血清，室溫30分鐘；
5、PBS洗5分鐘×2次；
6、一抗，4℃，16～24小時；
7、PBS洗5分鐘×2次；
8、二抗，室溫30分鐘，PBS洗5分鐘×2次；
9、滴加抗酶抗體，室溫30分鐘，PBS洗5分鐘×2次；
10、用過氧化物酶溶液作用30分鐘，PBS充分洗凈；
11、在DAB－H2O2液中進行顯色5～30分鐘，鏡下控制；
12、下同直接法。

六、過氧化物酶－過氧化物酶復合物法（PAP法）
原理
PAP法的基本原理與酶橋法相同，只是用酶和抗體制成的免疫復合物（PAP）代替了酶橋法中的抗酶抗體和隨后結合的酶，把兩個步驟合并為一個步驟。
優點：敏感性比間接法高20倍；
缺點：理論上PAP是一種復合物，因其不是抗HRP抗體，不能與HRP結合，不會造成背景染色，但在實際工作中仍存在比較重的非特異性背景染色。
基本染色方法
1、組織切片脫蠟至水；
2、用0.3％H2O2－甲醇在室溫中處理切片5～30分鐘；
3、充分水洗后，PBS洗5分鐘×2次；
4、1：20稀釋正常血清，室溫30分鐘；
5、滴加一抗（兔），4℃中反應13～24小時；
6、PBS洗5分鐘×2次；
7、加羊抗兔IgG，室溫30分鐘，PBS洗5分鐘×2次；
8、加PAP，室溫30分鐘，PBS洗5分鐘×2次；
9、用DAB顯色5～30分鐘；
10、蘇木素襯染、脫水、透明、中性樹膠封固。