人外周血淋巴細(xì)胞分離液

產(chǎn)品描述

外周血中單個核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞等細(xì)胞，其密度為 1.075g/ml~1.090g/ml ，粒細(xì)胞和紅細(xì)胞密度較大，為 1.090g/ml，血小板密度為 1.030g/ml~1.035g/ml。經(jīng)過密度梯度離心使一定密度的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞分離。

人外周血淋巴細(xì)胞分離液通過密度分離作用，用于樣本中不同成分的分離，以便于對樣本的進(jìn)一步分析。本產(chǎn)品由泛影酸、氫**鈉、羥**淀粉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、注射用水組成。

訂購信息

運輸與保存

常溫運輸。常溫避光保存，有效期24個月。

使用方法

實驗前準(zhǔn)備

1. 適用儀器：最大離心力可達(dá)1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機。

2. 抗凝劑的選擇

在動物實驗采血時，很多實驗者選擇醫(yī)用真空采血管獲得抗凝血，醫(yī)用采血管中的抗凝劑只考慮血漿質(zhì)量，但不利于高純度細(xì)胞分離實驗（或必須使用枸櫞酸鈉的醫(yī)用真空抗凝采血管）。

由于血漿中的纖維蛋白原活化成有活性的纖維蛋白，纖維蛋白交聯(lián)成纖維蛋白血凝塊，易使PBMC 形成細(xì)胞團(tuán)塊，不利于細(xì)胞的活化。肝素鈉抗凝劑可減輕上述情況發(fā)生幾率。分離出的PBMC 無需培養(yǎng)，而是用于其他檢測：選擇枸櫞酸鈉抗凝劑，分離效果好。

3. PBMC 最佳分離時間：血液離體后2h內(nèi)。如達(dá)不到2h內(nèi)分血條件，請務(wù)必于4h內(nèi)進(jìn)行分血步驟，超過4h很難順利進(jìn)行分離。

4. 分離液的使用環(huán)境

a. 分離液需常溫（37℃-15℃）避光保存，嚴(yán)禁冷藏冷凍保存；

b. 使用時嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)范（超凈工作臺或生物安全柜內(nèi)），并在18℃-22℃環(huán)境溫度下進(jìn)行操作，20℃條件下分離效果好。超出此溫度范圍，有可能使分離液密度發(fā)生改變，造成分離效果不佳。

5. PBMC 高效離心管

6. 參考值（目的細(xì)胞參考范圍）

本試劑可保證目的細(xì)胞的提取率大于80%，不是純度。如需獲得高純度目的細(xì)胞，請配合免疫磁珠分選。本試劑盒可減少磁珠的使用量，減少成本。

檢驗方法

全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在20±2℃（試劑需要復(fù)溫，夏季20℃，冬季23℃）的條件下進(jìn)行。血液樣本需要稀釋時，實驗方法如下：稀釋方法：1 份的PBS 或樣本稀釋液加2 份的血液進(jìn)行稀釋（PBS:抗凝血＝1:2）【注】：稀釋液要求：用不含鈣鎂離子的緩沖液或培養(yǎng)基進(jìn)行血液稀釋。

各種規(guī)格離心管的使用方法（推薦最佳方法）：取一支無菌離心管，加入分離液，然后緩慢加入血液樣本或新鮮抗凝血。血液樣本或新鮮抗凝血小心加于分離液液界面之上。（若采血量較少，需小量分離，分離液的量不得少于3ml，抗凝血量在0.2-3ml 之間）

1.     15ml 離心管（包括高效離心管）：

1.A. 最佳比例：5ml 分離液+ 4ml 稀釋過的血液；

1.B. 最佳離心條件：20℃環(huán)境下，500g 離心25min。

2.     50ml 離心管（包括高效離心管）：

2.A. 最佳比例：20ml 分離液+ 20ml 稀釋過的血液；

2.B. 最佳離心條件：20℃環(huán)境下，650g 離心30min。

未經(jīng)稀釋的抗凝血分離方法（細(xì)胞培養(yǎng)、或需保存血漿推薦用此方法）：

3.     使用15ml 離心管（或15ml 高效離心管）：

3.A. 15ml 普通離心管最佳比例：5ml 分離液+ 5ml 抗凝血；

3.B. 15ml 高效離心管最佳比例：4ml 分離液+ 5ml 抗凝血；

3.C. 最佳離心條件：20℃環(huán)境下，600g 離心25min。

3.【注】：獲得純度較高的血漿：離心后，吸取血漿層由上至下的2/3 處血漿，下1/3 處血漿可能包含部分PBMC 及少量分離液成分；

3.

4.     使用50ml 離心管（或50ml 高效離心管）：

A. 50ml 普通離心管最佳比例：20ml 分離液+ 20ml 抗凝血；

B. 50ml 高效離心管最佳比例：15ml 分離液+ 20ml 抗凝血；

C. 最佳離心條件：20℃環(huán)境下，600g 離心30min。

【注】：獲得純度較高的血漿：離心后，吸取血漿層由上至下的2/3 處血漿，下1/3 處血漿可能包含部分PBMC 及少量分離液成分。

實驗后續(xù)方案（以血液樣本5ml為例）

1.     離心后，離心管中由上至下分為四層。第一層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色（人）淋巴細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。

2.     ①小心吸取血漿層轉(zhuǎn)移到新離心管A 中。

2.②小心吸取離心管中的環(huán)狀乳白色（人）淋巴細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到新離心管B 中。

3.     向含有（人）淋巴細(xì)胞的離心管B 中，加入5-10ml 清洗液，混勻細(xì)胞。

4.     350-450g，離心10min。棄去上清。

5.     用吸管吸取5ml 清洗液重懸所得細(xì)胞。

6.     350-450g，離心10min，棄去上清。

7.     重復(fù)清洗兩次，棄去上清，用0.5ml 清洗液或根據(jù)下一步實驗要求加入相對應(yīng)液體，重懸所得細(xì)胞。

7.

分離過程中可能出現(xiàn)的情況及處理方案

情況一：淋巴細(xì)胞層混雜紅細(xì)胞

1. 吸取有紅細(xì)胞混雜的淋巴細(xì)胞層。

2. 取15 毫升離心管加入紅細(xì)胞混雜的淋巴細(xì)胞層，根據(jù)紅細(xì)胞殘余數(shù)量酌情加入5-8 倍

紅細(xì)胞裂解液。

a. 如有紅細(xì)胞混雜則加入適量紅細(xì)胞裂解液（產(chǎn)品編號：AP01L106  需另購）將紅細(xì)胞

裂解（具體方法見“紅細(xì)胞裂解液使用說明”）即得目的細(xì)胞。

b. 參考紅細(xì)胞裂解液說明書操作。少時多次裂解后獲得淋巴細(xì)胞。

注意事項

1.     本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。

2.     本試驗要求，在正常大氣壓下，樣本、分離液及分離環(huán)境溫度為 20℃±2℃,否則會影響產(chǎn)品質(zhì)量。

3.     本產(chǎn)品不得使用紫外線消毒，如出現(xiàn)渾濁、沉淀、絮狀物、包裝破損或漏液不得使用。

4.     關(guān)于血液分離液效果：

4.A. 臍帶血：臍帶血收集到細(xì)胞分離時長一般大于2 小時，冷藏存放與運輸在所難免。與外周血靜脈采血相比，大多臍帶血分離效果較差。

4.B. 案例：應(yīng)用過免疫動員劑類藥物，普通的樣本密度分離液分離效果較差，有大量的粒細(xì)胞混雜，不能使用。

5.     本實驗最好不使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無靜電、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品，因為靜電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面會變成毛面，影響細(xì)胞分離效果。

6.     吸取過多的淋巴細(xì)胞層及分離液層會導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒細(xì)胞數(shù)量增加。

7.     吸取過多的淋巴細(xì)胞層上層溶液會導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜。

8.     不當(dāng)?shù)南♂尫椒〞档图?xì)胞得率及活性。稀釋液要求：不含鈣鎂離子的緩沖液或培養(yǎng)基。血液樣本經(jīng)過稀釋則分離過程中需適當(dāng)降低離心力和離心時間。

9.     如實驗后細(xì)胞得率或活性過低，請聯(lián)系技術(shù)支持。

9.

10.  參考值（參考范圍）

本實驗淋巴細(xì)胞提取率大于80%。下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例，可適當(dāng)進(jìn)行參考。

11.  可能存在的問題及解決方法

由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：

12.  離心力公式及單位換算

13.  本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對離心條件進(jìn)行調(diào)整時，恒定離心時間，對離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。

14.  本分離液依照國際標(biāo)準(zhǔn)，全部使用藥用級原料，性能指標(biāo)與國產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同，可能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不*全的情況，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。【注】：在對離心條件進(jìn)行調(diào)整時，離心轉(zhuǎn)速的加減以50-100g 為基數(shù)，直至達(dá)到最佳分離效果，離心力最小不得小于400g，最大不得大于1200g。離心時間以20-30min 為準(zhǔn)。

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