預定用途：

Panbio登革熱IgM 捕獲ELISA法是一種定量檢測血清中登革熱IgM抗體的方法，可以作為臨床具有登革熱癥狀病人的臨床實驗室檢測輔助手段。Panbio登革熱捕獲ELISA法應和其它的登革熱血清學方法聯合應用。

登革熱，黃病毒屬B群黃病毒，廣泛存在于熱帶和亞熱帶地區。通過蚊子，主要是埃及伊蚊和白紋伊蚊傳播。感染了登革熱病毒在臨床上可以引起一系列從不明顯到致死性的登革出血熱癥狀。典型登革熱癥狀表現為突然發熱、激烈頭痛、肌痛、關節痛和出疹。還有二相熱型、失眠、由于味覺喪失或苦味導致的厭食等也很常見。登革出血熱和登革休克綜合征經常是伴隨二次血清感染出現的嚴重并發癥。

登革熱病毒IgM抗體ELISA檢測法是一種很有用的方法，尤其是在二次和后繼的多次感染中，那時并發癥的發生率很高。登革熱病人的血清IgM抗體能在發熱后3~5天就能檢測并通常能持續30~90天，雖然檢測水平可能在感染后的8個月都可存在。

IgM群血清抗體和粘附在微孔測試板聚笨乙烯表面上的抗人IgM抗體相結合。用抗原稀釋液把登革熱1~4號抗原濃縮液稀釋到恰當的工作容量。抗原由昆蟲細胞表達系統和一種免疫純化的單克隆抗體制得而成。在稀釋抗原中加入適量的辣根過氧化物酶（HRP）結合單克隆抗體（MAb）形成抗原-MAb復合物。洗去測試板內的殘存血清，加入抗原-MAb復合物。孵育后，洗滌微孔板，加入無色底物，四甲基聯苯胺/*（TMB/H2O2）。底物被酶水解后變成藍色。加酸終止反應后，TMB變成黃色。顏色的變化表明測試樣本中有抗登革熱IgM抗體。

1．抗-人IgM包埋微孔板—（測試板）微孔用抗-人IgM抗體包埋（12＊8個孔）。備用。不用的微孔板立即收好，貯存在有干燥劑的地方。在2-8oC穩定至失效。2. 登革熱1-4號抗原（重組體）— 一個透明有蓋的玻璃瓶，150 μL（藍色）濃縮的登革熱病毒抗原1,2,3和4號。沒有用過的稀釋的抗原一定要扔掉。濃縮的抗原貯存于2~8度直至失效。

3. 洗滌緩沖濃縮液— 一瓶60ml用吐溫20和防腐劑（0.1% ProclinTM）20倍濃縮的磷酸鹽緩沖鹽水pH 7.2-7.6。在低溫下可能會形成結晶。為避免這種情況，把它放在37oC直至變得透明。充分混勻。在1份洗滌緩沖濃縮液加入19份蒸餾水稀釋。稀釋的緩沖液在2~25oC可以貯存一個星期。

4. 血清稀釋液-兩瓶50ml裝（粉紅色）。備用。三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水pH 7.2-7.6 含防腐劑（0.1% Proclin）和添加劑。在2~8oC保持穩定直至失效。

5. 抗原稀釋液-一瓶50ml裝（透明色）。備用。磷酸鹽緩沖液含防腐劑（0.1% ProclinTM 和0.005% 慶DA霉素）。在2~8oC保持穩定直至失效。

6. 辣根過氧化物酶共軛單克隆抗體示蹤劑-一瓶7ml裝（黃色）。備用。辣根過氧化物酶共軛單克隆抗體示蹤劑含防腐劑（0.1% Proclin.）和蛋白穩定劑。在2~8度保持穩定直至失效。

7. 四甲基聯苯胺TMB-一瓶15ml裝。備用。3,3,5,5''-TMB和枸酸鹽緩沖液（pH 3.5-3.8）內的*的混合物。在2~8oC保持穩定直至失效。

8. IgM陽性對照血清-一個黑色有蓋的瓶子裝有200 μL人血清（含有0.1%疊氮化納和0.005%硫酸慶DA霉素）。在2~8oC保持穩定直至失效。

9. IgM標準血清-一個橙色有蓋瓶子裝有400μL人血清（內含0.1%疊氮化納和0.005%硫酸慶DA霉素）。在2~8oC保持穩定直至失效。

10. IgM陰性對照血清-一個白色有蓋的瓶子裝有200 μL人血清（含有0.1%疊氮化納和0.005%硫酸慶DA霉素）。在2~8oC保持穩定直至失效。

11. 終止液-一個瓶子15ml裝。備用。1M磷酸。在2~25oC保持穩定直至失效。

Proclin. 300是RohmHaas公司的注冊商標產品

對照和標準血清安全注意事項：

在這些成份里疊氮化納的濃度是有毒性的，是屬于下列級別R22, R32的：“吞食有毒"和“和酸接觸會釋放出有毒氣體"

另外必需具備但不提供的材料：

1 精確可調節微量移液器（5-1000 μL容量），配備一次性使用吸管

2 去離子水

3 微量培養板洗滌系統

4 酶標儀配備450nm濾波片

5 計時器

6 刻度量筒

7 燒瓶

8 血清稀釋用的試管或微量滴定板

9 抗原稀釋用的玻璃或塑料試管或瓶。

警示

用于體外診斷用

i 用在準備對照時的所有人類來源的材料在測試對人類缺陷性病毒1和2（HIV1和2）、丙型肝炎病毒以及乙型肝炎病毒表面抗原抗體時，都為陰性。但是沒有哪種方法能夠*保證，所以所有的人體對照和抗原都應該認為是潛在的感染源。疾病預防控制中心和國家健康署建議可能傳染的抗原應該在2級生物安全下進行處理。

ii 這種測試只能用血清。用全血、血漿或是其它的樣本間質不能做。

iii 黃疸的或黃體脂蛋白血清，或表現出溶血的，或有細菌生長的血清都不可用。

iv 不要加熱失活的血清。

v 在開始實驗前，所有的試劑必須要平衡至室溫（20~25oC）。試驗受到室溫變化的影響。只有達到了室溫才能把微孔板從密封包里拿出來。

vi 用干凈的槍頭直接在瓶子里配試劑。轉移試劑可能會導致污染。

vii 未用過的微孔板，應立即重新封存，并儲存有干燥劑的地方。如果不這樣做可能會造成錯誤的結果。

viii 底物系統

a 由于TMB易受金屬離子污染影響,所以不允許底物系統和金屬表面接觸。

b 避免長時間暴露于陽光直射下。

c 一些洗滌劑可能會干擾TMB的表現。

d TMB可能會有一些淡藍色。這個不會影響底物的活性或者試驗的結果。

警告

ix 這些試劑盒成份內含有疊氮HUA鈉，它可能與鉛或銅管道反應形成高爆炸性金屬疊氮化合物。當通過水管裝置來去除這些試劑時，用大量的水沖洗以防止疊氮積聚在排水管。

x 疊氮HUA鈉會抑制結合物的活性。必須用干凈的移液管槍頭來加結合物以致疊氮HUA鈉不會被其它試劑攜帶污染。

為獲得更多的安全信息請參照從PANBI0得到的原料安全數據表（MSDS）

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標本收集和準備

讓靜脈血在室溫下（20~25oC）凝結成塊，然后根據全國臨床實驗標準委員會NCCLS（收集診斷靜脈血的認可標準程序，H3-A4, 1998）進行離心。

血清應盡快分離并冷藏（2~8oC），如果在兩天內不試驗的話，就應該冷凍（-20oC或更低的溫度）。不推薦使用自我解凍的致冷機。黃疸血清、有溶血的、脂血的或是有細菌生長的血清都不推薦使用。CLSI提供貯存血樣的建議。（血樣處理加工的認可標準程序，H18-A2, 1999）。

注意：確保在實驗前，所有的試劑都平衡至室溫（20~25 oC）。在超出所提供的時間和溫度范圍內試驗可能會導致無效的結果。沒有在即定的時間和溫度內進行的試驗應重復一次。

血清預稀釋

i 從箔袋內拿出所需數量的微孔板，并插入夾板固定器。5個板分別是陰性對照，陽性對照和三個標準物。確保剩下未用的微孔板緊緊地密封在箔袋內。

ii 用合適的試管或微量滴定板稀釋陽性對照，陰性對照，標準物和病人樣品。

a 在10μL血清中加入1000μL血清稀釋液。充分混勻。或者

b 在10μL血清中加入90μL血清稀釋液。取出20μL稀釋的血清加入180μL血清稀釋液。充分混勻。

方法概括參見附圖

a抗原

i 確定好你試驗所需孔的數量。用抗原稀釋液稀釋抗原1/250。建議zui少要稀釋10μL 抗原至2.5ml抗原稀釋液。這樣才足夠做5條帶（共有40個孔）。每條帶都需要0.5ml稀釋的抗原。一旦抗原被加入了抗原稀釋液，那溶液就會變成淡藍色。確保剩下沒用的濃縮抗原貯存在2~8 oC。

ii 取出需要量的稀釋抗原，然后在一個干凈的玻璃或塑料瓶里混合相同體積的MAb 示蹤劑。輕輕地混勻抗原和MAb 示蹤劑溶液，再在室溫下保持至所需時。棄掉沒用過的稀釋抗原。

b 測試板

iii 混勻后10分鐘內，吸取100μL稀釋的病人樣本和對照，分別加入測試板相應的微孔內。

iv 蓋上測試板，在37 oC±1 oC孵育1小時。

v 用稀釋的洗滌緩沖液沖洗6次。（參見下面的沖洗步驟）

vi 混勻抗原和MAb示蹤劑。吸取100 μL混勻物，加入測試板相應的孔內。

vii 蓋上測試板，在37 oC±1 oC孵育1小時。

viii 用稀釋的洗滌緩沖液沖洗6次。（參見下面的沖洗步驟）

ix 在每個孔內加入100 μLTMB。

x 從*次加入算起，在室溫下20-25 oC培育10分鐘。藍色將會出現。

xi 按TMB加入的時間和順序，在所有的孔內加入100 μL終止液。混勻。藍色將會變成黃色。

xii 30分鐘內讀數，波長450nm，參照濾波器600~650nm。

注意：如果是雙波長分光光度計，在600~650nm間設定參照濾波。如果在450nm讀數沒有參照濾波時，可能會由于背景因素出現更高的吸光值。

有效的沖洗能去除沒有混合的樣品或成分，這對于ELISA程序是很有必要。

A. 全自動沖洗板

1 吸光所有孔內容物。

2 在沖洗過程中，洗滌緩沖液要注滿孔（350 μL）

3 6次沖洗完后，把板翻轉，在吸水紙上用力敲打確保去除所有的沖洗緩沖液。

4 全自動沖洗板一定要維護好，確保沖洗效果。在所有時間內都要遵照制造商的沖洗說明。

B. 人工沖洗

1 把內容物倒入合適的廢物缸。

2 用一個合適的擠壓瓶把洗滌緩沖液加滿孔，避免起泡，因為這可能會降低沖洗效果。立即倒掉緩沖液。

3 重新加滿，再立即倒掉。

4 再重復4次步驟3。總共用洗滌緩沖液洗6次。

5 洗完zui后一次后，倒掉孔內容物，把板翻轉，在吸水紙上用力敲打確保去除所有的沖洗緩沖液。

每個試劑盒包括標準物，陽性對照和陰性對照血清。

在隨附的說明表列有這些血清合適值。那陰性和陽性對照是用來監測由試劑引起的失敗。陽性對照不能確保試驗臨界點的精確度。如果對照或標準的吸光度值沒有達到說明書標準，則測試無效，就應該重做。如果測試無效，病人結果就不能報告。質量控制需要必須遵照當地的、州和/或國家法律或委任書和你們實驗室標準質量程序。

建議用戶參照NCLSI C24-A和42 CFR 493.1202c中的合適的質量控制實踐指導。

計算：

重要提示：校準系數是一組特性，詳細列在說明書上了。在開始計算前，得到校準系數值。

1 計算三個標準物的平均吸光度值，然后和校準系數相乘。這就是臨界值。

2 樣品的吸光度除以臨界值就得到指數值。

或者

3 指數值乘以10就得到Panbio 單位。

指數值=樣品的吸光度/臨界值

例如：樣品A的吸光度=0.949

樣品B的吸光度=0.070

標準物的平均吸光度=0.802

校準系數=0.62

臨界值=0.802 X 0.62=0.497

樣品A 0.949/0.497=1.91 指數值

樣品B 0.070/0.497=0.14 指數值

Panbio 單位=指數值 X 10

樣品A  1.91 X 10 = 19.1 Panbio 單位

樣品B  0.14 X 10 = 1.4 Panbio 單位

通過來自東南亞/南美和澳大利亞Queensland的人口數據得到臨界值。這其中包括有208個有特性的陰性，91個陽性和110個病例對照樣本。通過二圖接受器操作特性分析得到臨界值。選擇1.0的臨界比例是基于靈敏性和特異性的*F值。

登革熱感染的診斷：登革熱IgM捕獲ELISA法檢定病人血清中IgM抗體水平。陽性結果（> 11 Panbio 單位）表明急性初次或二次登革熱感染。如果要區分是初次還是二次感染，就應該用到登革熱Duo ELISA法。

下面推薦一種報道結果的方法：由Panbio登革熱IgM捕獲ELISA法得出下列結果。不同方法得出的結果不能互換。測量結果超出臨界值不表示現有抗體總量。結果應該報告為陽性、陰性或可疑，而不能報數值。

1. 臨床診斷必須根據臨床癥狀和病人體征來解釋。從試劑得來的結果不是診斷性的。應該結合臨床數據和病人癥狀來考慮。

2. 在不同的地理區域，人群血清流行病學可能會隨著時間的改變而變化。因此，那臨界值可能需要根據當地的研究進行調整。

3. 不能用來做一般人群的篩查。陽性預值依賴于現存在病毒的可能性。只能對有臨床癥狀的病人進行測試，或者有可疑暴露時。

4. 和黃病毒屬出現血清學交叉反應是常見的事（即在登革熱1，2，3，4型和墨累山谷腦炎病毒，日本腦炎病毒，黃熱病病毒，西尼羅河病毒等之間）。在確診前必須排除這些疾病。

5. 免疫測定中的嗜異染抗體是一種很好識別的干擾原因。這些動物IgG抗體可能會與試劑IgG抗體交叉反應并產生假陽性。這在確診前也必須被排除。

6. 沒有為可視的結果確定建立表現特征。

7. 這個測定利用昆蟲表達蛋白。人類抗-昆蟲抗體的交叉反應或干擾對測定結果來說是不可知的。

8. 根據Panbio登革熱IgM捕獲ELISA法，所有的血清都顯示為一個陽性結果時，這時應該送交參照實驗室進行確定和流行病學記錄。

9. Panbio登革熱Duo ELISA（E-DEN01D）測定IgG是zui方便的。它用和IgM ELISA相同的捕獲法。所以測定IgM和IgG用的是相同的方法和相同的血清稀釋液。另外，Panbio間接IgG ELISA法能和IgM捕獲ELISA法聯合使用，它的臨界吸光度是急性二次感染的臨界標準值的4倍。IgG Panbio單位也能用來區分登革熱初次和二次感染。

登革熱初次感染表現為在感染發作后的3~5天IgM水平很高或是顯著升高，能持續3~5個月。二次感染表現為感染發作后的1~2天特異性IgG的升高，而且大部分病例>70%還伴有IgM的升高。在早期感染和一些二次感染中IgM抗體的可檢測水平可能很低。一些病人在感染后的頭7~10天可能不會產生可檢測到水平的抗體。只要癥狀還存在，我們就建議在*份樣本后的7天對病人重新進行測試。

作為內部研究的一部分，我們用Panbio登革熱IgM捕獲ELISA法對255份有特性的血清進行了測試。那血清包括83份地方性的血清陰性樣品，57份初次登革熱感染病人的樣品，以及115份二次登革熱感染病人的樣品。測試結果與登革熱的血清狀況進行比較以測定那方法的靈敏性，特異性和一致性。數據見表1。

表1 Panbio ELISA血清學靈敏性和特異性與登革熱疾病狀況的比較

Panbio登革熱IgM捕獲ELISA法

95% CI＊

血清學靈敏性（初次感染）  = 54/57   = 94.7%    85.4 – 98.9%

血清學靈敏性（二次感染）  = 64/115  = 55.7%    46.6 – 64.7%

血清學特異性（血清陰性）  = 83/83   = 100%    95.7 – 100%

血清學一致性             = 137/140  = 97.9%   93.7 – 99.6%

（排除了二次感染血清）

a可疑樣本的重測試沒有計算在內，因為那些樣本是無效的。

＊CI=可疑區間

重現性

為了測定Panbio登革熱IgM捕獲ELISA法試劑盒的重現性，我們用3個批號的試劑盒在不同的3天對7份血清每份進行了3次測試。用方差分析對組內，日間，組間和總的精密度進行了分析。結果見表2。

表2 Panbio登革熱IgM捕獲ELISA法精密度測定（用指數值＊）

所有的值都是從指數值計算得來的

SD=標準差； CV=變異系數

注意：由于列表原因，標準差結果保留兩位小數

＊樣品吸光度除以臨界值得到指數值。

通過測試一組115份來自其它確診病人（非登革熱）的樣品來測定Panbio登革熱IgM捕獲ELISA法的診斷特異性。那樣品來自于患有可能存在交叉反應疾病的病人。測試中的每份樣品的Panbio登革熱IgM捕獲ELISA法分析都要服從于其疾病診斷。在疾病組中，zui小的交叉反應見于瘧疾，西尼河病毒和類風濕因子樣品。結果參見表3。

表3 Panbio登革熱IgM捕獲ELISA法-交叉反應分析