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【適用儀器】本試劑盒適用于ABI7000，ABI7300，ABI7500，ABI7900，MJ-chromo4，MX3000P，MX3005P，SmartCyclerⅡ，Rotor-Gene6000，Lightcycler R480，iCycleriQ4，iCycleriQ5，Bio-Rad CFX96，SLAN等多色熒光PCR儀及相應軟件。

【標本要求】

人體鼻腔或咽部分泌物:用無菌捻拭子拭取鼻腔或咽部分泌物，將分泌物或咽拭子置入無菌玻璃管（含0.4ml滅菌生理鹽水），用無菌棉球將試管塞緊后，密閉送檢。標本可立即用于檢測，也可保存于-20℃待測。【檢驗方法】

1.標本、對照品的核酸裂解處理

用商品化（取得醫療器械許可證）的RNA提取試劑盒處理標本，具體操作參見該試劑盒說明書。

或用Trizol法提取，方法如下：取100?l樣品置于1.5ml 離心管中，加入300?l裂解液（Trizol），再加入100?l氯仿，混勻器上振蕩混勻5sec或顛倒混勻15次； 13000rpm離心15min，吸取上層液體，加入等體積異丙醇，顛倒混勻室溫靜置10min， 13000rpm離心10min，輕輕倒去上清；加入700?l 75%乙醇，顛倒洗滌，13000rpm離心5min，輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，棄盡液體或4000rpm離心5sec，將管壁上的殘余液體甩到管底部，用微量加樣器盡量吸干液體，加入20?l DEPC-H2O溶解RNA。

2.試劑配制

取n×19?l H7N9核酸熒光PCR檢測混合液與n×1?l RT-PCR酶（n為反應管數）,振蕩混勻數秒, 3000rpm離心數秒。

3.加樣取上述混合液20?l置于PCR管中，然后將樣品核酸提取液、DEPC-H2O、陽性對照品各5?l分別加入PCR管中，蓋好管蓋，立即進行PCR擴增反應。

4. PCR擴增反應管置于定量熒光PCR儀上，推薦循環參數設置：

45℃×10min; 95℃×15min;循環一次，再按95℃×15sec→60℃×60sec，循環45次;單點熒光檢測在60℃，反應體系為25?l。

熒光通道檢測選擇：選用FAM通道。

備注：如使用ABI系列PCR儀，請務必于passive reference 和 quencher處均選擇“none”。

5. 閾值設定

閾值設定原則以閾值線剛好超過DEPC-H2O的zui高點。

6. 質量控制：試劑盒各對照品須達到以下要求，否則實驗視為無效。

Ct值
FAM通道（檢測H7）		HEX/VIC/JOE（檢測N9）
DEPC-H2O	UNDET或45		UNDET或45
陽性對照品	≤35		≤35

7. 試驗結果的判斷

通道	Ct值		結果判斷
1	FAM+HEX	UNDET或45	樣本低于檢測限，報告為陰性
2	FAM+HEX	≤43	FAM通道為H7基因陽性； HEX/VIC/JOE通道為N9基因陽性
3	FAM+HEX	43～45	復檢一次,如仍為43～45,則報告為陰性

進行定量檢測時，儀器生成標準曲線后，自動顯示待檢樣品定量值。

【參考值范圍】陰性（檢測對象H7N9為病原微生物，在健康人體中不存在）。

【對檢驗結果的解釋】實驗室環境污染，試劑污染，樣品交叉污染會出現假陽性結果；試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或定量檢測不準確的結果。

【檢驗方法的局限性】當檢測樣本中被檢核酸濃度含量低于zui低檢測限5×103copies/ml時可能會發生假陰性的結果。

【產品性能指標】zui低檢測限：1×103copies/ml；

【注意事項】開始檢測前請仔細閱讀本說明書全文。

1. 整個檢測過程應嚴格分在三區進行：PCR反應體系的配制區；標本處理、加樣區；PCR擴增、熒光檢測及結果分析區。各區使用的儀器、設備、耗材和工作服應獨立。實驗后即請清潔工作臺，并進行消毒。

2. 使用不含熒光物質的一次性手套（經常替換）、一次性離心管、自卸式移液器和帶濾嘴吸頭。

3. 試劑準備和標本處理應使用超凈工作臺（負壓式）或防污染罩，以防止對環境污染。

4. 每次實驗應設置陰、陽性對照品。

5. 操作人員應經過專業培訓，具有一定經驗和操作技能。

6. 操作臺、移液器、離心機、PCR擴增儀等儀器設備應經常用10%次氯酸或75%酒精、紫外線燈或臭氧消毒處理。

7. 實驗中接觸過標準品和對照品的廢棄物品（如吸頭）、擴增完畢的離心管、標本等應進行無害化處理后方可丟棄。

8. 試劑使用前應在常溫下充分融化并混勻。

9. PCR反應混合液應避光保存。

10. 反應管中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊。

11. 不同批號的試劑請勿混用，請在有效期內使用試劑盒。

生產單位：廣州市輝康生物科技有限公司

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