甘露醇

甘露醇是一種糖醇，作為凍干注射劑中最常見的輔料之一，在小分子和大分子藥物凍干制劑廣泛應用，主要作用是用作填充劑。通常情況下，甘露醇會被添加到低濃度配方中，提高配方的濃度，有效防止凍干過程中產品向上或向外飄散，另外還能幫助形成機械強度高且外觀優雅的凍干粉餅，這也是凍干產品的一個重要特性。

為什么甘露醇是一種受歡迎的填充劑？

★ 它是一種穩定的結晶性非吸濕性固體；

★ 它可溶于水，20℃時溶解度為18.6%w/w；

★ 它的化學性質穩定，作為非還原性糖醇，甘露醇不會與胺類發生美拉德反應；

★ 它在注射給藥時不會產生不良反應。

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甘露醇的物理形態及特點

甘露醇分為結晶態的無水甘露醇，無定形態的甘露醇以及甘露醇半水合物；其中結晶態的無水甘露醇又分為不同的晶型，β-、α-和δ-型，在常溫條件下，β-型具有熱力學穩定性，其穩定性順序為 β> α >δ。δ-型在絕對零度時保持熱力學穩定。β-型與α-型呈單向轉變相關性，而δ-型則與α-型和β-型存在對映異構關聯。通過冷凍干燥水溶液獲得的無水甘露醇形態，可能受溶質濃度及冷卻速率、熱處理等工藝參數的影響。無水甘露醇的物理形態似乎不會影響最終產品的質量特性。

在冷凍的水溶液中，甘露醇也可能形成半水合物的形式（MHH C?H??O?0.5H?O）。研究顯示這種半水合物僅在低溫下保持穩定<-20°C，在常溫條件下，MHH是一種亞穩態水合物。它傾向于脫水并形成無水甘露醇。

預凍過程中形成的半水合物（MHH）若滯留在凍干制劑中，可能對最終產品性能產生影響：

① 若在凍干工藝中（未進行退火處理）出現MHH形成不一致的情況，可能影響生產工藝的可靠性；

② 若采用激進的干燥工藝脫除MHH的水分，可能引發活性藥物成分（API）降解；

③ 儲存期間晶格水的釋放會顯著影響制劑組分的理化穩定性。這些釋放的水分會被非晶態組分吸附，導致玻璃化轉變溫度降低，進而增加反應活性或結晶傾向。

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甘露醇與其它制劑組分的相互作用

在上市的產品配方中，有些產品輔料中除了甘露醇外，還會有其它的輔料物質，這就為甘露醇和其他輔料以及活性成分API之間提供了相互作用的可能性。這類相互作用可能影響甘露醇在凍干工藝各階段及最終制劑中的物理形態，同時可能影響其他輔料的物理形態，進而影響最終產品的質量屬性。

甘露醇與雙糖相互作用

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蔗糖和海藻糖是蛋白質及多肽凍干制劑中常用的穩定劑。這兩種糖的塌陷溫度（Tc）相對較低，蔗糖為-32℃，海藻糖為-29℃。由于一次干燥過程需要在低于塌陷溫度下進行，溫度越低，干燥干燥時間會變得越長，此時如果添加甘露醇可形成部分結晶基質，從而為非晶相提供宏觀“支撐"，若干燥溫度超過Tc，非晶相會因結晶成分形成的剛性基質作用而產生難以察覺的粘性流動，這種成熟的方法已用在多種商業化制劑中，如Kepivance®,  Leukine®, Enbrel®, Nplate®, Simulect®, Nulibry®等，在這些產品中，甘露醇與糖的比例通常≥2：1，雖然雙糖作為穩定劑保護活性成分，但甘露醇的結晶會為無定形相提供支撐。

反過來，蔗糖和海藻糖對甘露醇的結晶具有濃度依賴性抑制作用，有研究表明：

① 在低甘露醇與蔗糖比例（≤1：1，w/w)時，蔗糖會抑制甘露醇在冷凍溶液中的結晶，而甘露醇僅在較高比例（>2：1)時才會結晶。當甘露醇與蔗糖比例為1：2時，即使經過退火處理，甘露醇仍保持無定形態。而在甘露醇與蔗糖比例為1：1時，甘露醇僅在退火后發生結晶。在含2：1比例甘露醇和蔗糖的配方中，甘露醇在冷凍過程中（以0.5℃/min速率）發生結晶。含有甘露醇和蔗糖的蛋白質配方也觀察到類似現象；

② 當甘露醇與海藻糖的比例較低（≤1：2)時，甘露醇的結晶過程受阻，在冷凍溶液中保持無定形態。即使進行激進的退火處理（-18°℃下持續22h），這些配比下的甘露醇結晶仍無法實現。在中等比例（1：1或2：1）時，海藻糖在冷凍過程中抑制了甘露醇結晶。但后續退火處理會使甘露醇結晶形成，進而促進二水合海藻糖的結晶過程。值得注意的是，在3：1的高比例下，甘露醇反而發生結晶，此時海藻糖仍保持無定形態。

甘露醇與蛋白的相互作用

大多數蛋白質在冷凍濃縮過程中仍保持無定形態，并可能以濃度依賴的方式抑制甘露醇的結晶過程以及MMH的形成，Liao等人研究了在甘露醇和蔗糖3:1含量的配方中蛋白對甘露醇結晶的影響。該蛋白質對甘露醇結晶表現出濃度依賴性的抑制作用，且在蛋白質濃度≥30 mg/mL時效果明顯。

反過來，甘露醇的結晶也可能會影響蛋白的穩定性，有研究通過使用乳酸脫氫酶（LDH）作為模型蛋白，凍干含甘露醇-蔗糖的配方體系中得到了驗證。研究中，采用較低的蛋白質濃度（15 mg/mL）排除其自穩定的影響，同時確保即使在低糖濃度（0.5% w/v）下仍能保持高糖蛋白比。通過改變甘露醇與蔗糖的比例（1：5至9：1)并引入退火步驟（-20°C，4h）到凍干工藝中，可調節甘露醇結晶程度。如預期所示，更高的甘露醇濃度和退火處理增強了結晶性。

此外，退火降低了酶活性回收率（4%至18%)。甘露醇結晶程度越高，酶活性回收率越低。含甘露醇制劑中殘留酶活性的降低還伴隨著蛋白質二級結構的變化。考慮到所有樣品的糖蛋白比均>1，這種不穩定性不能歸因于糖的濃度不足。但是，吐溫PS80（0.01%w/v）的加入在凍干產品中保留了LDH的活性，同時，不影響甘露醇的形態或結晶度。

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配方中含有甘露醇

會面臨的潛在問題及應對策略

MHH的形成與預防

在典型的蛋白質配方中，當甘露醇與蔗糖的配比較低且退火溫度低于-10°C時，這些因素會顯著促進MHH的形成。如前面所述，甘露醇半水合物（MHH）的形成不僅會引發工藝穩健性問題，還可能對產品穩定性產生重大影響。即便僅有少量甘露醇以MHH形式殘留，釋放的水分也會導致頂空相對濕度顯著升高，從而為蔗糖結晶創造有利條件，進而對蛋白的穩定性產生影響。

因此，通常建議是在凍干過程中二次干燥溫度設置≥40℃以使充MHH充分脫水。第二個方案則是將產品置于冷藏環境中儲存，以充分延緩MHH的脫水過程，但是這個方案通常不是我所期望的。另外，也有個別研究表明，儲存期間MHH脫水沒有影響到蛋白質的穩定性。當觀察到成品凍干粉中存在MHH的情況下，需要謹慎確定MHH脫水對產品穩定性的影響。

鑒于MHH對蛋白屬性的影響，我們可以通過提高退火溫度（> -10°C）或通過控制冰晶成核過程，可以實現無水甘露醇的結晶，即有效抑制甘露出半水合物MHH的形成。在生產工藝實施前，可通過差示掃描量熱法（DSC）和X射線衍射法（XRD）系統研究這兩種方法對甘露醇結晶行為的影響，確保在整個過程中沒有MHH的形成和存在。

破瓶現象

凍干工藝中含有甘露醇的制劑易發生碎瓶現象，可能導致藥品損失、清理溢出物的額外成本，以及需要延長檢查時間以確保所有破裂小瓶被及時丟棄。

實驗觀察到小瓶破損現象在冷凍和升溫過程中均有發生，其嚴重程度取決于甘露醇濃度與溫度變化速率。快速凍融循環結合高濃度的甘露醇（15% w/v）會導致小瓶破損率顯著上升，而緩慢升溫速率搭配低濃度甘露醇（5%w/v）則能大幅降低破瓶的風險。破瓶主要源于冷凍過程中藥物膨脹產生的內部應力。當甘露醇未充分結晶，在升溫過程中，與其結合的水被釋放并結晶，冰的密度為0.92 g/cm3，而水的密度約為1.0 g/cm3（在0°C時）。當水結晶成冰時，體積會增加9%，這種體積突變可能會超過瓶子的抗壓強度，從而引發碎瓶。

通過調整降溫速率，使其進行緩慢冷卻，降低灌裝量以及進行退火處理等來有效減少破瓶的風險。根據FDA，在對凍干注射產品的申請進行審查時，一個常見的缺陷是關于退火步驟降低藥瓶破損風險（美國食品藥品監督管理局藥品生產評估辦公室OPMA）。原文是" A representative comment: “It is noted that annealing step is not included in your proposed lyophilization cycle although crystalization of mannitol during freezing is critical to minimizing the risk of vial breakage. Comment on what controls, if any, have been put into place to mitigate the risk associated with vial breakage during lyophilization and storage"代表性意見指出：“需注意的是，雖然甘露醇在冷凍過程中結晶對降低藥瓶破損風險至關重要，但貴司擬定的凍干工藝流程中并未包含退火步驟。請說明是否已采取相關控制措施來降低凍干及儲存過程中藥瓶破損的風險。

瓶內異質性

高灌裝體積/高度的藥品凍干存在顯著挑戰，當預凍溶液中的溶質濃度較高時，這些挑戰會更加嚴峻。一個可能的后果是最終產品在瓶內的不均勻性。當含有甘露醇的配方進行凍干時，其物理形態呈現異質性特征。通過同步輻射X射線衍射技術對甘露醇-蔗糖/海藻糖溶液(10% w/v；蛋糕高度2cm）制備的凍干制劑進行垂直剖面分析顯示：凍干機頂部和底部的MHH含量較低，而向中心區域顯著增加。這一現象表明，凍干制劑中可能存在高MHH含量的特定區域，不同區域的活性藥物成，從而導致瓶內藥物穩定性的不均一性，可通過退火處理來消除這種異質性。

總結

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作為凍干制劑（小分子和大分子藥物）中的輔料，甘露醇可有效實現兩大目標：

① 通過高溫進行一次干燥，大幅縮短凍干時間并降低成本；

② 形成機械強度高且外觀優雅的凍干制劑。

但需注意確保最終產品中甘露醇結晶，可通過引入退火步驟實現，引入退火步驟以達到以下目的：

① 降低藥瓶破損風險；

② 使凍干制劑的干燥行為和組成趨于均一；

③ 減少儲存期間甘露醇結晶的風險。

當用于大分子藥物配方時，甘露醇與二糖（蔗糖或海藻糖）≥2：1的比例可以確保甘露醇結晶，并使一次干燥更快，而凍干保護劑保持無定形并穩定蛋白質。配方中加入甘露醇可能與以下問題有關：

① 小瓶破損。可通過適當選擇制劑成分和組成、灌裝高度、小瓶尺寸、冷卻速率、退火溫度和時間來預防；

② 亞穩態甘露醇半水合物MHH的形成與保留。在這種情況下，選擇適當的退火溫度和時間以避免半水合物的形成，并盡可能通過在高溫（≥40℃）下進行二次干燥來確保脫水。但是需要注意，只有當API不具有熱不穩定性時，才有可能實現這一點。

盡管研究表明甘露醇還具有其它功能性，比如無定形態保護劑，復水性能增強劑，滲透壓調節劑等，但它目前仍然還是凍干制劑中的填充劑，在使用過程中，我們需要精心“駕馭"，充分理解其特性，精準把控配方及工藝參數，才能揚長避短，讓它真正成為打造高質量凍干產品的利器。

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