配方篩選失敗的三大根源

做過凍干配方研發的人都知道一種痛苦：實驗做了一輪又一輪，數據堆成山，卻始終找不到那個"穩定又好用"的配方。這種困境并不罕見。問題出在哪里？復盤來看，幾乎所有失敗案例都指向三個共同原因：

01

變量過多、缺乏優先級。研發人員面對十幾種候選賦形劑，傾向于全部納入實驗，結果變量數量呈指數級膨脹。沒有做好文獻預篩，每個組合都進入實驗，最終數據量巨大但信噪比極低。

02

終點指標不清晰。什么叫"配方通過"？如果團隊內部對此定義不一，實驗設計便缺乏統一錨點。有人認為外觀合格即可，有人要求SEC聚集體不超過0.5%，也有人更關注活性、復溶時間或殘余水分，指標分歧會直接導致判斷混亂。

03

缺乏系統性設計思維。"窮舉法"是配方研發最常見的反模式——把能試的組合都試一遍，期待運氣降臨。這種做法不僅資源消耗巨大，還無法建立因果理解，下一個項目依然從零開始。

解決這三個問題，需要從實驗設計的根源入手——這正是DoE（Design of Experiments，實驗設計方法）的價值所在。

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為什么DoE思路必須從第一天介入

很多團隊把DoE當作"后期優化工具"，只有在配方粗篩完成后才引入。這是一個嚴重的認知誤區。

傳統方法（OFAT，One Factor At a Time）的邏輯是：固定其他變量，只改變一個因素。這種方法看似嚴謹，實則存在根本缺陷——它無法捕捉變量之間的交互效應。凍干配方的穩定性恰恰是多因素協同作用的結果：蔗糖濃度、緩沖液pH、蛋白濃度、凍干保護劑種類之間存在大量非線性交互。OFAT在這類系統面前幾乎是盲人摸象。

相比之下，DoE方法通過精心設計的實驗矩陣，用更少的實驗次數系統探索多變量空間，并能量化變量交互效應。研究顯示，一個設計合理的部分因子設計（Fractional Factorial Design）通常可以用OFAT方法實驗量的1/4~1/3獲得同等甚至更全面的信息。

從法規角度看，ICH Q8(R2)《制藥開發》明確要求申請人"理解制劑的設計空間（Design Space）"，并將關鍵物料屬性（CMA）與關鍵工藝參數（CPP）對產品質量的影響系統記錄在案。在監管語境下，DoE是建立這種理解并提供文件證據的標準工具。

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萊奧6步配方篩選流程

步驟1

確認蛋白基本理化特性

配方設計的起點是深入了解目標蛋白的物理化學性質。核心參數包括：分子量（MW）和等電點（pI）——兩者共同決定蛋白在不同pH和離子強度下的帶電狀態與聚集傾向；SEC-HPLC初檢結果——了解原料藥中單體比例、聚集體與片段水平；DSC熱掃描——獲取蛋白的熱變性溫度，這是后續配方篩選的基準值。

同期需要明確目標產品質量屬性（TPP）：活性保留率≥90%、殘余水分≤2%、復溶時間≤2分鐘、外觀（餅形完整、白色均一、無明顯塌陷）。TPP是整個篩選過程的"驗收標準"，必須在實驗設計前以書面形式確認。

步驟2

基于文獻+先例數據縮窄候選范圍

在進入實驗室之前，應充分利用已有的文獻信息和先驗數據，將候選賦形劑空間壓縮到可管理的范圍。推薦參考FDA非活性成分數據庫（FDA Inactive Ingredient Database），該數據庫收錄了FDA已批準注射制劑中所有賦形劑的使用記錄，可直接確認候選賦形劑的法規可接受性。

同類蛋白（相近MW/pI范圍）的已發表配方研究是另一重要信息來源。基于文獻整理，通常可將候選保護劑縮窄至3～5個（如蔗糖、海藻糖、甘露醇及其組合），候選緩沖液體系縮窄至2～3個（如磷酸鹽、組氨酸、檸檬酸鹽體系），大幅降低后續實驗工作量。

步驟3

DSC/DSF/nano-DSF初篩—熱穩定性快速排序

熱穩定性篩選是配方初篩階段高效的工具。差示熒光法（DSF）采用96孔板格式，高通量完成多個配方組合的Tm測定。Nano-DSF利用蛋白內源性色氨酸熒光，適用于對外加染料敏感的蛋白體系，數據精度更高。

判斷標準：與無賦形劑參照組相比，候選賦形劑使Tm提高≥2°C，通常可認為具有值得進一步驗證的熱穩定化效果。低于2°C的Tm提升往往接近方法波動范圍，不建議單獨作為篩選依據。

重要提示：熱穩定性篩選（Tm）反映的是溶液態的熱穩定性，與固態凍干過程中的保護效果并非直接等價。某些賦形劑可能在溶液態對Tm提升不明顯，但在凍干的固態基質中卻能提供優異的保護（反之亦然）。因此，本步驟的目標是快速排除明顯不利或無效的候選方案，而非作為配方選擇的終判標準。

經過DSF初篩，通常可將候選組合進一步壓縮至5～8個，進入下一階段的凍干驗證。

步驟4

小規模凍干實驗驗證

通過熱穩定性篩選的配方，需要在真實凍干條件下進行驗證。小規模凍干實驗使在實驗室級凍干機上執行精確控制的程序，確保所有配方候選在相同的工藝條件下接受評估。

關鍵檢測指標：餅形外觀（視覺評分）、殘余水分（Karl Fischer滴定法，目標≤2%）、復溶時間（目標≤2 min）、SEC-HPLC單體純度。這一步驟的核心目的是排除"熱穩定性好但凍干行為差"的偽候選配方。

步驟5

加速穩定性測試（40°C/75%RH，4周起）

凍干固態制劑的加速穩定性測試條件與液態制劑存在顯著差異，需特別關注密封條件下的水分重吸收效應。關鍵評估指標：SEC-HPLC聚集體含量變化（Δ聚集體%）、氧化修飾、活性保留率、外觀。

建議測試節點：T=2周（中期檢查）、T=4周（第一階段判斷）、T=8周（確認測試）。4周數據決定候選配方是否進入最終確認，8周數據作為ICH Q1A加速測試的初步證據。

步驟6

確認配方 → 固化配方設計空間

經過前5步篩選，通常有1～2個優選配方進入最終確認階段。核心任務是建立配方的"知識空間"邊界——關鍵賦形劑的可接受濃度范圍（例如：蔗糖8%～12% w/v，組氨酸緩沖液pH 5.8～6.2）。

輸出文件包括：配方開發報告（含所有實驗數據、統計分析結果及配方選擇理由）、賦形劑選擇合理性說明（Excipient Justification）——作為CTD 3.2.P.2節《制劑研發》的核心輸入文件，是后續IND/NDA申報的法規基礎。

4

5個高頻篩選陷阱（必須回避）

陷阱①：跳過DSF/Tm初篩，直接做凍干實驗

這是資源浪費最嚴重的做法。凍干實驗從樣品制備到結果獲得通常需要2～4周，而DSF篩選只需1天。正確做法：永遠先做DSF，把凍干機留給真正值得驗證的候選配方。

陷阱②：只檢測外觀，不做SEC-HPLC

外觀合格與蛋白完整性完好是兩個不同的概念。大量可溶性聚集體（亞微米級）在外觀檢查中根本無法發現，但同樣具有免疫原性風險。SEC-HPLC檢測可溶性聚集體，必須納入每一輪配方篩選的檢測矩陣。

陷阱③：加速穩定性只做2周就下結論

2周數據不具備統計意義，僅適合早期快速排除明顯不穩定的配方。4周是業界低判斷標準。提前在2周時下結論，極易將"慢速降解"的劣質配方誤判為穩定。

陷阱④：不固定凍干參數就比較不同配方

配方篩選和工藝開發必須嚴格分階段進行。如果不同配方使用了不同工藝參數，穩定性差異將無法區分來源。解決方案：配方篩選階段固定一套標準凍干程序，專注于配方變量的比較。

陷阱⑤：用不同批次蛋白做不同輪配方實驗

蛋白原料藥的批間差可能顯著影響配方篩選結果。正確做法：配方篩選全程使用同一批次原料藥；若必須換批，需進行批間橋接實驗（bridging study）后方可合并數據分析。

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萊奧德創凍干工廠

技術優勢

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核心優勢

先進的凍干設備和軟件(PATs)，凍干理念與技術 (QbD，Line of Sight )

● SMART™ 自動化工藝摸索技術，為產品提供數據支持的初步工藝；

● ControLyo® 可控瞬時成核技術，對成核溫度進行精確控制，確保產品均一性；

● LyoFlux® TDLAS技術，對蒸汽質量流量進行精確測量，精確判定凍干終點；

● Tempris® 無線溫度傳感器，提供產品溫度實時監測與記錄；

● Biopharma 凍干前后分析技術，對產品配方進行特征研究，避免凍干過程開發風險。