背景與需求

基因組編輯技術的突破性進展顯著促進了新型細胞與基因療法的開發。該技術不僅能實現現有基因的精準修飾，還可用于構建合成基因，在異基因治療中構建免疫相容性細胞，為臨床提供“現成"治療方案。然而，基因編輯技術的安全有效應用仍有賴于新型工具的開發。其潛在風險主要來自兩方面：一是在培養過程中獲得的突變可能導致細胞惡性轉化，以及在具有DNA修復缺陷的細胞中引發基因組不穩定性；二是編輯工具可能在基因組非目標位點引發DNA斷裂，產生脫靶效應。脫靶編輯可能激活原癌基因或破壞抑癌基因，從而推動腫瘤發生。此外，脫靶誘變還可能產生新抗原，誘發自身免疫反應或其他細胞功能障礙。

因此，開發一種能在全基因組范圍內高精度、無偏倚地檢測編輯誘導的DNA雙鏈斷裂（DSB）的技術，對于評估基因編輯療法的安全性、加速其臨床轉化具有核心意義。

技術方案：INDUCE-seq 的原理

INDUCE-seq是一種可擴展的DNA斷裂定位與表征平臺技術。它旨在解決上述安全性評估難題，其核心在于利用一種新型的無PCR原位斷裂捕獲方法。

?      無PCR偏差：INDUCE-seq 是無偏倚的、基于細胞的解決方案，根本上避免了因PCR擴增偏好性，確保了檢測結果的客觀性與真實性。

?      廣泛兼容性：INDUCE-seq具有廣泛的細胞類型兼容性，與多種治療相關的細胞類型兼容，并適用于任何基于核酸酶的基因編輯系統，普適性強。

?      高精度檢測：INDUCE-seq能夠以高精度檢測任何基于核酸酶的基因組編輯系統誘導的DNA斷裂。

INDUCE-seq工作原理

如圖1所示：在CRISPR-Cas9介導的基因編輯過程中，其核心步驟可分為兩個連續的生物學階段，并分別對應特定的高通量測序檢測方法以實現對編輯事件的精準解析。第一階段為基因編輯的“啟動期"（Initiating Phase），即Cas9核酸酶在sgRNA引導下于預設基因組靶位點（通常鄰近PAM序列）誘導產生雙鏈斷裂（Double-Strand Break, DSB），該過程伴隨基因組不穩定性與DNA斷裂事件的發生；

INDUCE-seq技術的核心創新即在于此階段——它通過在細胞原位對DSB末端進行特異性標記（如連接化學修飾的P5測序接頭），實現對斷裂位點的高精度捕獲與定位，且因建庫過程無PCR擴增，每個測序讀長嚴格對應單個DSB事件，從而獲得無偏倚的1:1斷裂信號表征。第二階段為“編輯期"（Editing Phase），細胞啟動內源性DNA修復機制，包括易出錯的非同源末端連接（NHEJ）或精確的同源定向修復（HDR，需供體DNA模板），修復結果在靶位點引入插入、缺失、框移或點突變等遺傳改變，最終實現基因敲入、敲除、條件性等位基因構建或報告基因整合等基因修飾目標；此階段的遺傳變化可通過Duplex-seq等高通量方法進行檢測。因此，INDUCE-seq與Duplex-seq分別從“斷裂發生"與“修復結果"兩個維度，構建了從DNA損傷到基因編輯終產物的完整監測體系，為解析CRISPR編輯的動態機制與優化編輯效率提供了系統性的實驗框架。

INDUCE-seq操作流程

如圖2所示，在原位斷裂標記實驗中，首先對固定并透化的細胞進行DSB末端標記：通過將經化學修飾的全長P5測序接頭連接至經末端預處理（如末端修復與平端化）的DSB末端，實現斷裂位點的特異性標簽化。隨后，提取基因組DNA（gDNA），經物理或酶促片段化處理，并對片段末端再次進行標準化預處理，以確保接頭連接的兼容性。接著，使用經化學修飾的半功能性P7測序接頭進行二次連接，從而在DNA文庫中形成兩類片段：一類為功能性DSB標記片段（P5:P7結構，攜帶DSB標簽），另一類為非功能性基因組背景片段（P7:P7結構，無DSB標簽）。在測序前，通過流式細胞術（Flow Cell Enrichment）對文庫進行富集，選擇性捕獲并保留P5:P7結構片段，從而高效去除非功能性P7:P7背景DNA。由于INDUCE-seq建庫流程避免了PCR擴增步驟，每個測序讀長（read）在統計學上嚴格對應單個細胞中一個被標記的DSB末端，確保斷裂事件的定量表征無擴增偏差。與依賴PCR的非NGS方法相比，該方法實現了DSB信號的1:1無偏映射，避免了PCR引入的擴增偏好性與信號失真，從而提供更精確、可重復的基因組斷裂圖譜。

獨立驗證：HESI 交叉驗證研究

一項在健康與環境科學研究所（HESI）的CT-TRACS委員會框架下開展的試點研究，旨在評估INDUCE-seq方法的可靠性。其設計是使用兩種不同的細胞類型（GM24385和MCF10A），對五個經過充分研究的遺傳靶點進行CRISPR-Cas9基因編輯，該技術可實現突變位點的高靈敏度檢測。

流程一 測量基因組中的斷裂，評估靶向和非靶向基因編輯

基于INDUCE-seq技術獨特的數字讀數特性，開發的脫靶位點篩選流程整合了斷裂重復序列分析與引導RNA同源性分析，可生成潛在脫靶位點的超集，其分層報告系統支持將位點分為常見型、無偏型和序列依賴型三類并進行概率分析，HBD基因編輯位點的斷裂分布可視化結果如圖所示

流程二  高保真糾錯測序技術定量位點的遺傳變化

如圖所示高置信度類別脫靶突變，表明斷裂計數與突變積累之間存在顯著比例關系。其中對照樣本中的突變率反映了突變的背景水平。

INDUCE-seq性能驗證

如表1所示，NDUCE-seq表現出優異的檢測性能。

NDUCE-seq 可重復地、無偏倚地檢測基因編輯誘導的DNA雙鏈斷裂

結果顯示，在三次重復實驗中，總斷裂數和基于序列的脫靶位點數量均具有高度可重復性。不同細胞類型中DSBs的積累趨勢存在差異，而CRISPR-Cas9活性峰值出現在轉染后6小時。對五個靶點的分析進一步證實，靶向與非靶向DSBs的檢測結果穩定且一致。

結論

INDUCE-seq 提供了一個數據驅動的、具有可操作性的見解平臺，旨在加速基因編輯項目在研發、臨床前和臨床階段的發展。通過其無偏倚、高精度且可重復的DNA斷裂檢測能力，它為解決基因編輯療法的安全性評估難題提供了關鍵工具，有助于確保這些創新療法的安全開發。

Broken String Biosciences是英國卡迪夫大學的衍生公司，致力于幫助基因編輯團隊加快更安全、更有效的基因藥物的開發。其成功開發出的一種高靈敏度、全基因組范圍的DNA雙鏈斷裂檢測新方法——INDUCE-seq®，不僅可精準識別基因編輯工具在預設靶位點誘導的雙鏈斷裂，還可系統性捕獲其在基因組非靶向區域引發的脫靶斷裂事件。目前，Broken String Biosciences已與全球多家基因編輯企業建立戰略合作，為其提供早期、全面的編輯效應評估服務，從而助力提升產品安全性評價的科學性與可靠性，加速從臨床前研究向臨床應用的轉化進程。本技術的核心使命在于增強基因編輯過程的可預測性與可控性，推動基因編輯技術向安全、有效、可監管的臨床治療方案穩健發展。

北京西美杰科技有限公司是Broken String Biosciences中國一級代理，始終秉承著專業、嚴謹的態度為客戶提供優質的產品與服務。